杜 风，陈翌阳，张 楠，徐俊玄，宁婷婷，朱圣韬*，张澍田

首都医科大学附属北京友谊医院 1.消化内科；2.检验科，北京 100050

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)已成为全球第三大恶性肿瘤,我国CRC的发病率也持续上升[1]。尽管近年来CRC的诊断及治疗技术有所改善,但晚期CRC的复发率和死亡率依旧较高,因此早期发现和及早治疗对CRC患者至关重要[2]。此外,由于CRC患者间和肿瘤内的异质性较高,免疫治疗仅对少数患者有效,而对占绝大多数的微卫星稳定型CRC效果较差[3]。因此,发现更有效的治疗靶点和疗效预测标志物成为迫切的临床需要。

叉头框(forkhead box,FOX)家族是一个极具保守性的转录因子家族,存在于从酵母到人类的所有物种,具有共同的DNA结合结构域,即FOX结构[4]。FOX基因参与许多生物学过程,特别是细胞凋亡和分化,广泛介导细胞命运决定、细胞周期、细胞迁移和代谢[5]。除在正常发育过程中发挥重要作用外,FOX基因也参与肿瘤的发生[4]。Yoshida等研究表明FOXM1促进小鼠CRC的发生和生长[6]。FOXK2通过上调ZEB1和EGFR促进CRC转移[7]。FOXC1通过反式激活ITGA7和FGFR4的表达促进CRC进展[8]。以上研究证实了FOX家族在CRC发病机制中的关键作用。叉头框L2旁基因(forkhead box L2 neighbor,FOXL2NB)是FOX家族的重要一员。一项关于CRC关键致癌基因鉴定的研究表明,FOXL2NB与CRC总体生存期缩短相关[9]。此外,FOXL2NB是头颈部鳞状细胞癌和鼻咽癌预后模型的重要一员,具有较高的预测效率[10-11]。以上研究提示FOXL2NB是潜在的致癌调节因子,但FOXL2NB结直肠癌中的表达和临床意义尚未见报道,有待进一步明确。

本研究将联合癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和生物学实验验证,探究FOXL2NB在结直肠癌中的表达和临床意义,并通过功能实验分析FOXL2NB在结直肠癌细胞恶性表型的作用,从而更好地评估结直肠癌的早期诊断与治疗。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:DMEM培养基(Hyclone公司);胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司);蛋白分子量标志物、BCA蛋白定量试剂盒、Trizol、SYBRMix(Thermo Fisher Scientific公司);Lipofectamine2000转染试剂、OPTI-MEM培养基(Invitrogen公司);siRNA(苏州吉玛生物公司);M-MLV反转录酶(Promega公司);引物(上海生工生物公司);RIPA裂解液(北京碧云天公司);CCK-8检测试剂盒(Solarbio公司);Transwell小室(Corning公司);FOXL2NB抗体(PA5-66360,Invitrogen公司);β-actin抗体(66009-1,Proteintech公司)。

1.1.2 细胞系:人正常结直肠上皮细胞系NCM460和人CRC细胞系SW620、HT29、CACO2、SW480和SW837购买自上海中国科学院细胞中心。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR检测人结直肠癌细胞中FOXL2NB的mRNA水平:使用Trizol提取总RNA后进行反转录和cDNA合成,按常规流程操作。使用GAPDH作参照,以2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达。所用引物为FOXL2NB:(正向)5′-TCCCCAAGATGTGCC TTCAC-3′,(反向)5′-GACGCTTCCCTAGTAGAGCT G-3′;GAPDH:(正向)5′-GGAGCGAGATCCCTCC AAAAT-3′,(反向)5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCAT GG-3′。

1.2.2 免疫印迹法检测人正常及肿瘤细胞中FOXL2NB的蛋白表达:冰上加入SDS液裂解细胞后,按照免疫印迹标准流程,应用FOXL2NB、β-actin抗体分别检测目的分子和内参分子的蛋白表达水平。

1.2.3 小干扰siRNA转染:使用lipofectamine 2000和100 nmol/L siRNA的转染体系,按转染试剂盒流程将siRNA序列导入SW620细胞系。小干扰siFOXL2NB序列:5′-CCTGGTGAAGAAGAGGATGC CTGAT-3′;siNC:5′-UGCUGUUGCUCCUGCUCCAG-3′。

1.2.4 CCK-8细胞活力检测:培养细胞至对数生长期,胰蛋白酶消化制备单细胞悬液。96孔板接种2×103个细胞/孔。接种后即刻及连续3 d加入CCK-8反应液,按照说明书测定吸光度(A)值。根据细胞生长曲线计算细胞生长速率。

1.2.5 Transwell实验:培养细胞至对数生长期,胰蛋白酶消化制备单细胞悬液。用不含血清的培养基重悬细胞,上室加入细胞悬液(4×104个细胞/孔),下室加入10%血清培养基。24 h后擦除上室细胞,固定液固定5 min,结晶紫染色10 min,显微镜下观察计数。

1.2.6 TCGA数据库分析:从TCGA数据库收集CRC转录组和临床信息,其中包含了473例CRC标本以及41例健康标本。利用R语言进行limma差异表达统计和可视化分析。

1.2.7 FOXL2NB与预后指标的相关性分析:以基因表达的中位数为标准,利用Rsurvminer和Rsurvival程序包绘制Kaplan-Meier曲线,揭示分子表达和生存率(总生存期和无进展生存期)之间的关系。

1.2.8 多因素Cox回归分析:将有显著意义的临床数据和FOXL2NB表达值纳入多因素Cox回归分析,采用Rsurvival程序包计算95%置信区间和风险比率。

1.2.9 基因集富集分析(gene set enrichment analy-sis,GSEA):以FOXL2NB表达中位数为标准,制备FOXL2NB表达矩阵文件(.gct)、表型信息文件(.cls)。在分子特征数据库(MSigDB)下载预定义基因集文件(.gmt)。使用基于JAVA环境的GSEA软件(version 3.0),经过1000次重复迭代,明确FOXL2NB高低表达组信息聚类通路。

1.2.10 免疫相关性分析:利用CIBERSORT法,对24种免疫细胞的表面标志物表达峰度进行分析,以探究FOXL2NB与免疫细胞之间的关联性。使用Rcorrplot包进行统计分析和可视化。

1.3 统计学分析

本文实验数据采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析和可视化。正态分布计量资料采用单向或双向方差分析,组间采用配对或非配对t检验;非正态分布数据使用非参数检验Mann-Whitney检验统计结果的显著性。

2 结果

2.1 FOXL2NB在CRC细胞和组织中表达升高

结直肠癌细胞系的RT-qPCR和免疫印迹结果表明,CRC细胞中FOXL2NB的mRNA及蛋白含量显著高于正常结肠上皮细胞(P<0.05)(图1A,B)。对TCGA数据库473例CRC患者和41例正常对照组织进行差异表达分析发现,与CRC中FOXL2NB的表达水平明显高于正常组织(P<0.05)(图1C)。在41组配对CRC组织中同样发现,CRC中的FOXL2NB表达量显著高于正常对照(P<0.05)(图1D)。

A.RT-qPCR assay for the expression of FOXL2NB mRNA; B.Western blot assay to detect the FOXL2NB protein level; C.FOXL2NB mRNA expression in colorectal cancer (n=473) and normal tissues (n=41) based on TCGA data; D.mRNA expression of FOXL2NB in 41 pairs of colorectal cancer and normal tissues from TCGA database; *P<0.05 compared with NCM460.图1 FOXL2NB在结肠癌细胞和组织中高表达Fig 1 FOXL2NB is upregulated in CRC cells and tissues

2.2 下调FOXL2NB抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移

RT-qPCR和免疫印迹结果显示,SW620细胞中siFOXL2NB显著降低FOXL2NB的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)(图2A,B)。CCK-8结果显示,当FOXL2NB的水平下降,会导致细胞生长受阻(P<0.05)(图2C)。Transwell结果显示,下调FOXL2NB显著降低结直肠癌细胞的迁移能力(P<0.05)(图2D,E)。

A,B.RT-qPCR and Western blot assays to detect the knockdown effect of siFOXL2NB in SW620 cell; C.CCK-8 assay for determining cell proliferation; D.Transwell measures cell migration capacity(scale bar=100 μm); E.statistical chart of the number of migrating cells; *P<0.05 compared with siNC.图2 FOXL2NB 表达下调抑制结直肠癌细胞增殖和迁移Fig 2 Down-regulation of FOXL2NB expression inhibited colorectal cancer cell proliferation and migration

2.3 FOXL2NB高表达与CRC患者不良预后相关

Kaplan-Meier生存分析结果显示,FOXL2NB的表达水平越高,CRC患者的总体生存时间越短(图3A)。FOXL2NB表达水平与CRC无进展生存时间负相关(图3B)。多因素Cox回归分析发现,FOXL2NB高表达是CRC预后不良的独立风险因素(HR=2.27,95%CI=1.78-2.9,P<0.001)。

A.overall survival curve; B.progression-free survival curve.图3 FOXL2NB表达与结肠癌患者预后的关系Fig 3 Correlation between FOXL2NB expression and prognosis of colorectal cancer patients

2.4 FOXL2NB高、低表达组间免疫特征性改变

GSEA分析结果显示,FOXL2NB高表达组中分泌IgA的肠道免疫调控网络、抗原加工呈递、细胞因子-受体相互作用、趋化因子信号通路、T细胞受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、Toll样受体信号通路和B细胞受体信号通路等免疫相关通路被显著富集(NES>1,NOMP<0.05,FDR<0.25),提示FOXL2NB表达异常可能与结直肠癌肿瘤免疫密切相关。此外,FOXL2NB高表达还与细胞黏附分子通路相关(NES>1,NOMP<0.05,FDR<0.25)。进一步CIBERSORT肿瘤免疫浸润分析结果显示,与FOXL2NB低表达组相比,FOXL2NB高表达组中CD8+T细胞和活化树突状细胞浸润显著增多,而M0巨噬细胞的浸润显著减少(P<0.05)(图4)。Circos基因相关性分析显示,FOXL2NB的表达与SCRT2、MGAT5B、SELENOV、FOXB1、KCNA4、LRRC14B和SLC32A1等分子表达正相关。

图4 FOXL2NB表达与免疫细胞浸润的相关性Fig 4 Correlation between FOXL2NB expression and immune cell infiltration

3 讨论

早期发现、早期诊断和治疗是CRC防治的关键,但由于早期CRC的临床特征隐蔽,大多数患者在诊断时已为晚期[2]。因此,探索早期CRC潜在诊断和预后生物标志物至关重要。本研究发现FOXL2NB在CRC组织和细胞中表达显著上升,且FOXL2NB高表达的患者总体生存期和无进展生存期显著缩短,可作为CRC不良预后的独立风险预测因素。既往多项研究也表明FOXL2NB是肿瘤关键预后基因。Dai等发现FOXL2NB与CRC患者总体生存期缩短相关[9]。Tian等基于FOXL2NB等基因构建头颈部鳞状细胞癌预后模型可预测患者的总体生存期[11]。在鼻咽癌中,基于FOXL2NB等分子的预后模型也具有较高的预后预测效率[10]。因此,FOXL2NB有望成为CRC的关键预后指标。

目前关于FOXL2NB的功能研究较少。本研究提示FOXL2NB在CRC中的可能促癌功能,敲低FOXL2NB可显著抑制CRC细胞的增殖活性和迁移能力。进一步分析了FOXL2NB促进CRC进展的潜在分子机制,提示FOXL2NB高表达可能与多个免疫相关通路相关,包括分泌IgA的肠道免疫调控网络、抗原加工呈递、趋化因子、T细胞受体、自然杀伤细胞相关细胞毒性作用等。作为肿瘤微环境中适应性免疫的核心,CD8+T细胞在FOXL2NB高表达CRC中浸润增多,提示FOXL2NB高表达的CRC患者对免疫治疗可能更加敏感。此外,肿瘤组织内和巨噬细胞的存在也会影响肿瘤的形态和进程,大部分实体瘤内浸润的树突状细胞数量越多,预示患者对免疫治疗更敏感[12]。本研究发现,FOXL2NB高表达组中活化树突状细胞显著增多,而M0巨噬细胞显著减少,同样提示FOXL2NB高表达患者对免疫治疗可能更加敏感。

肿瘤细胞黏附和迁移能力与肿瘤转移密切相关,是肿瘤细胞侵袭和转移的限速环节。MGAT5B(乙酰氨基葡萄糖转移酶B)主要作用于N-聚糖和O-甘露聚糖的α连接甘露糖,在调节整合素和层纤蛋白依赖的细胞黏附和迁移中发挥积极作用。本文GSEA分析显示,FOXL2NB高表达除了与多个免疫通路相关外,还与细胞黏附分子通路密切相关。在基因相关性分析中也发现,FOXL2NB与MGAT5B分子表达正相关。以上提示FOXL2NB可能参与CRC细胞之间及其与细胞外基质间的相互作用,在CRC细胞生长和迁移中发挥关键作用。

综上,本研究发现了FOXL2NB在CRC中表达上调且与较差预后相关,可作为CRC预后不良的预测因素。FOXL2NB在CRC中可能作为促癌因子发挥作用,敲低FOXL2NB可显著抑制CRC细胞的增殖和迁移,为CRC发生发展调控研究提供了新的线索。