刘芳 欧德渊 万文华

摘要：高致病性猪蓝耳病发病率高，传播速度快，一旦发病会给养殖业带来巨大威胁。扑尔敏作为 H1受体拮抗剂，抗组胺作用持久，具有明显的中枢抑制作用，西咪替丁是一种可选择性 H2受体拮抗剂。为了研究这两种组胺受体拮抗剂对高致病性蓝耳病肺炎中 IL-1和 TNF-a 含量的影响，本研究建立了仔猪实验模型，测定了不同组别猪只 IL-1和 TNF-a 的含量，结果表明，阳性组、扑尔敏组和西咪替丁组 HP-PRRS 患猪主要炎性因子 IL-1、TNF-α极显著高于阴性组，但阳性组、扑尔敏组、西咪替丁组差异不显著，表明组胺 H1R拮抗剂扑尔敏和组胺 H2R拮抗剂西咪替丁对 HP-PRRS 患猪肺脏主要炎性因子 IL-1、TNF-α无影响，扑尔敏缓解 HP-PRRS 仔猪肺炎与肺脏中 IL-1、 TNF-α无明显的关联。

关键词：高致病性蓝耳病；扑尔敏；西咪替丁；IL-1；TNF-α

以蓝耳病病毒基因组非结构蛋白 Nsp2编码区缺少30個氨基酸为特征的猪高致病性蓝耳病（Highly pathogenic por? cine reproductive and respiratory syndrome ，HP －PRRS ），传播速度快，死亡率高，给养猪业带来了巨大的经济损失。

蓝耳病病毒感染猪只后，能刺激产生辅助性、杀伤性 T 细胞，还可刺激释放多种单核细胞因子，如 IL－1、IL －6、 IL －8、TNF －a、IFN－β、IFN－γ等等。其中， 白细胞介素－1（Interleukin－1， IL －1） 由单核细胞和巨噬细胞合成、分泌产生，与相应高亲和力受体结合后，可直接作用于体温调节中枢，使猪只发热，促进巨噬细胞、嗜中性粒细胞的招募与活化，使血管扩张，进一步介导炎症反应，当肺脏损伤或受病原微生物侵袭后，肺泡巨噬细胞能通过分泌细胞因子发挥调节免疫应答、介导炎症反应等作用，HP －PRRS 自然感染猪血清中的IL－1含量显著高于正常对照组[1]。肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor ， TNF ）是一种具有多种生物学效应的细胞因子，创伤、感染等应激状况时均可刺激 TNF－a 表达增加。TNF－α是炎症反应的关键细胞因子，在炎症局部组织和血清中表达水平上升，具有刺激巨噬细胞，趋化嗜中性粒细胞等作用[2]。受蓝耳病病毒感染的患猪外周血中的 TNF－a 表达水平显著升高[3]，由此可见，HP －PRRS 肺脏 IL－1、TNF－a 的含量能作为判断患猪肺炎发生的主要依据之一。

一、材料

（一） 主要试剂

高致病性蓝耳病病毒为贵州分离株 GZKB 株，由贵州省动物疫病研究室惠赠。猪 IL－1和 TNF－α ELISA 检测试剂盒，购至大连宝生物公司。

（二） 主要仪器

全自动酶标仪（ ELX808）， BioTek Instruments ，Inc。

二、方法

（一） 模型建立

从贵州省贵阳市某养殖户购买了没有注射蓝耳病疫苗的30日龄三元杂交公猪，共计20头，筛选的体重范围为8.9～11kg ，随机平均分为四个组，每个组5头，即阴性对照组、阳性对照组、扑尔敏组、西咪替丁组等4个组。其中阳性组、扑尔敏组、西咪替丁组仔猪同一时间肌肉注射 PRRSV （106TCID50）2mL／头，扑尔敏组、西咪替丁组于注射病毒前1d 开始，每日相同时间段分别肌肉注射扑尔敏1.5mL／头、西咪替丁1.5mL／头，阴性组为每日同一时间段肌肉注射生理盐水2mL／头。

（二） 肺样采集与处理

人工感染蓝耳病病毒第10d ， 阴性组体况正常， 阳性组、扑尔敏组、西咪替丁组仔猪有明显的临床症状，采取颈静脉放血的方法处死20头实验仔猪，取新鲜肺样立即放于液氮中冷冻固定。称取固定重量的肺样，用蒸馏水按相同稀释倍数进行稀释，研磨后离心取上清液测定肺脏 IL－1和TNF－α。

（三）标准曲线建立

按 ELISA 试剂盒说明书操作，建立肺脏 IL－1和 TNF－α标准曲线，具体步骤如下。

第一， 标准品的稀释。 IL －1的稀释浓度依次为：25pg／mL、50 pg／mL、100 pg／mL、200 pg／mL、400 pg／mL； TNF－α稀释浓度依次为：7.5ng／L 、15 ng／L 、30 ng／L、60 ng／L 、120 ng／L 。第二，加样。首先设空白对照孔（空白孔中不加样品、酶标试剂，其他步骤相同）、标准孔。加标准品样50μL 于酶标包被板上，加样时需将样品加于酶标板孔的底部，且加样时尽量不触及孔壁，放于微量振荡器上轻轻混匀。第三，温育。采用封板膜封板，并置于37℃下温育30min 。第四，配液。使用蒸馏水30倍稀释试剂盒中的30倍浓缩洗涤液，备用。第五，洗涤。轻轻揭去封板膜弃液体，甩干，将洗涤液加满每孔，静置30s，弃液体、拍干，重复5次。第六，加酶。除空白孔外，其余每孔加入50μL 酶标试剂。第七，温育、洗涤。操作分别同第三、第五。第八，显色。每孔先加50μL 显色剂A，再加50μL 显色剂 B，于微量振荡器上轻轻震荡混匀， 置于37℃下避光显色15min。第九，终止。每孔加50μL终止液，终止反应（此时蓝色立转黄色）。第十，测定。使用酶标仪将空白孔调零作对照，测量各孔450nm波长下的吸光度（ OD值）。需在加终止液终止反应后的15min 内测定 OD值。

（四）肺脏样品检测

标准曲线建立成功后，按 ELISA 试剂盒说明书操作，检测各组仔猪肺脏 IL －1和 TNF－α含量，具体步骤为：首先设空白对照孔（空白孔中不加样品、酶标试剂，其 他步骤相同）、标准孔、待测样品孔。准确加50μL 标准品样于酶标包被板上，先加40μL 样品稀释液于待测样品孔中，然后加10μL 待测样品（样品的稀释度是5倍）。加样品于酶标板孔底，注意尽量不碰触孔壁，置于微量振荡器上轻轻震荡混匀。余下步骤同标准曲线建立步骤的第三至第十。

（五）结果判定与数据分析

计算出标准物的浓度与对应OD值的标准曲线直线回归方程，将样品的 OD值代入方程式中，可获得被测样品的浓度，乘以样品的稀释倍数后为被测样品的实际浓度，最后统计各组仔猪肺脏IL－1和TNF－α的含量，并对数据进行分析。

三、结果

（一） IL－1和 TNF－α标准曲线

采用酶联免疫分析方法，按猪 IL－1和 TNF－αELISA试剂盒说明书操作要求，倍比稀释标准样品，用 ELISA法测定不同浓度标准品 A450后绘制标准曲线（见图1、图2），得出 IL－1倍比稀释标准浓度与 A450的关系公式为 y＝0.0085x－0.0771，相关系数为0.9921，TNF－α倍比稀释标准浓度与 A450的关系公式为 y＝0.0043x－0.0645，相关系数为0.9949，相关系数均接近1，公式较可靠。

（二） 各组仔猪肺脏 IL－1含量

结果如表1所示，人工感染病毒组仔猪肺脏 IL－1极显著高于阴性组（ P＜0.01），阳性组、扑尔敏组和西咪替丁组之间差异不显著，三组中，扑尔敏组 IL－1含量最低。

（三）各组仔猪肺脏 TNF－α含量

结果如表2所示，人工感染病毒组仔猪肺脏 TNF－α极显著高于阴性组（ P＜0.01），阳性组、扑尔敏组和西咪替丁组之间差异不显著，这与仔猪肺脏 IL－1含量变化相似，三组中，扑尔敏组 TNF－α含量最高，西咪替丁组 TNF－α含量最低。

四、讨论与小结

（一） 肺炎与 IL－1和 TNF－α表达的关系

在细胞因子研究中，致炎因子主要包括 IL－l及 TNF－α等，在疾病感染早期含量较高，对疾病的发展程度有指示作用。本研究中，使用组胺受体拮抗剂后测定 IL－1和 TNF－α含量，有助于探索组胺受体拮抗剂对 HP－ PRRS 患猪肺脏炎症的影响，对防治蓝耳病具有一定意义。

（二） 两种组胺受体拮抗剂对 HP－PRRS患猪肺脏 IL－1的影响

IL－1是免疫应答和炎症反应的基本要素和致热原[4]，本实验中人工感染病毒组仔猪 IL－1异常升高，阳性组、扑尔敏组和西咪替丁组分别增高了2.1倍、1.8倍、2.0倍，极显著高于阴性组，且阳性组、扑尔敏组、西咪替丁组仔猪均发生肺炎病变，说明在 HP－ PRRS早期，IL－1介导了肺部炎症的病理过程，但扑尔敏组、西咪替丁组的 IL－1较阳性组差异不显著，且实验中联合开展的仔猪肺脏病理学评分，扑尔敏组评分最低，说明扑尔敏缓解 HP－PRRS仔猪肺炎与肺脏中 IL－1的分泌和作用无明显的关联。

（三）两种组胺受体拮抗剂对 HP－ PRRS 患猪肺脏 TNF－a 的影响

本实验中人工感染病毒组肺脏 TNF－α含量极显著高于阴性组，与报道的肺气虚性肺气肿模型组肺组织 TNF－a较阴性组极显著增高相似[5]，可能是蓝耳病病毒通过刺激肺泡巨噬细胞释放 TNF－ a，使肺组织中 TNF－a 的 mRNA表达水平升高，但正常情况下血液中含 TNF－a 的水平较低，说明 TNF－α介导了 HP－ PRRS仔猪肺炎的病变。但也有资料表明 PRRSV感染初期引起 TNF－a转录轻微上调，到感染后期转录又受到轻微抑制[6]； 体外单独感染 PRRSV 后 PAM TNF－a转录下调，这些可能与病毒毒株或检测组织的不同有关。在本研究中我们发现，过量的炎性因子的表达与HP－PRRS患猪的肺炎有密切关系，但实验中扑尔敏组、西咪替丁组 TNF－α含量较阳性组差异不显著，表明组胺 H1R拮抗剂扑尔敏和组胺 H2R拮抗剂西咪替丁对炎性因子 TNF－α的释放无影响，且扑尔敏组仔猪肺脏病理学评分最低，说明扑尔敏缓解 HP－ PRRS仔猪肺炎与肺脏中 TNF－α无明显的关联。

（四）小结

阳性组、扑尔敏组、西敏替丁组 HP－PRRS患猪主要炎性因子 IL－1、TNF－α极显著高于阴性组，但阳性组、扑尔敏组、西敏替丁组三组之间差异均不显著，表明组胺 H1R拮抗剂扑尔敏和组胺 H2R拮抗剂西咪替丁对 HP－PRRS患猪肺脏主要炎性因子 IL －1、TNF－α无影响，扑尔敏缓解HP －PRRS 仔猪肺炎与肺脏中 IL －1、TNF－α无明显的关联。

参考文献：

[1]李建臻.川渝地区 HP-PRRS分子流行病学调查及自然病例猪血清IL-1和 TNF-α含量测定[D].重庆：西南大学，2009.

[2]朱晓菡，林愛琴，寇应琳，等.血清 IL-8与 TNF-α和 MCP-1对革兰阴性菌感染呼吸机相关性肺炎的诊断价值[J].中华医院感染学杂志，2021，31（23）：3532-3536.

[3]李华，杨汉春，黄芳芳，等.猪繁殖与呼吸综合征病毒感染抑制猪瘟疫苗的免疫应答[J].中国兽医学报，2001（03）：219-222.

[4]李华，杨汉春，郭玉璞.猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染的免疫学研究进展[J].中国兽医杂志，1999（09）：40-42.

[5]王哲，王莹，王守岩，等.肺气虚型肺气肿模型大鼠 ET IL-1β及 TNF-α含量变化[J].中华中医药学刊，2009，27（11）：2344-2346.

[6]蒲静.PRRSV对猪肺泡巨噬细胞天然免疫功能影响的分子机制[D].北京：中国农业大学，2005.

作者简介：刘芳（1985-），女，贵州清镇人，硕士，兽医师，研究方向：基础兽医学。

（责任编辑冯会利）