朱雯琪, 王俊凯, 孙建安, 毛相朝

(中国海洋大学食品科学与工程学院, 山东 青岛 266100)

马尾藻(Sargassum)是马尾藻科、马尾藻属一类的褐藻总称,现有大约250种[1],广泛分布于暖水和温水海域,中国沿海各地均有分布。马尾藻是非直接食用的经济藻类,具有较高的加工价值[2]。目前世界上已经发现了60余种的马尾藻被广泛报道应用在食品、医药[3]、纺织和化工等领域[4]。作为提取海藻酸(Alginate)原料是马尾藻重要商业用途之一[5],因季节气候等环境因素,不同种类马尾藻的海藻酸含量为12.4%～26.2%[1]。

海藻酸又名藻酸、褐藻酸或海藻素,化学式为(C6H8O6)n,相对摩尔质量约为10 kDa～600 kDa,分子结构如图1所示[6]。海藻酸是从褐藻中提取的一种广泛使用的天然有机多糖[7],纯品通常为白色或棕黄色的纤维、颗粒或粉末。海藻酸在自然状态下存在于细胞壁和细胞间质中,在强化细胞壁中起着重要作用[3]。海藻酸及海藻酸盐由于其特殊的结构与性质,在医药、食品、材料和固定化细胞中有应用价值。

图1 海藻酸分子示意图

海藻酸和海藻酸盐在医药领域得到广泛的应用。海藻酸是制药工业中常见的赋形剂。海藻酸-抗酸剂也可以改善食道反流病,研究发现海藻酸钠具有抗反流屏障的作用[9]。海藻酸水凝胶可用作蛋白质和药物输送系统,也可用作支架材料。海藻酸纳米颗粒已经用于药物递送[9]。在食品领域,海藻酸及海藻酸盐通常作为一种天然食品添加剂,通过其固有的理化性质来改善不同食品的特性、结构和营养价值[10-11]。海藻酸盐是一种天然多糖,无任何毒副作用,大分子网络结构容易膨胀且柔韧性高[12]。由于其较低的成本、丰富的原材料来源和良好的可塑性等优点,被广泛应用于天然材料可降解包装膜材料[13]。在组织工程领域中,海藻酸盐作为支架材料的优势在于其柔韧性可以完全适应组织缺损,并且可以同时加载生物活性分子[14]。在农产品加工领域,已开发出海藻酸钠混合磷酸盐及谷氨酰胺转氨酶等制取的新型鲅鱼糜保水剂[15]。海藻酸及海藻酸盐作为海洋中存在的一种可再生资源,基于其结构和性质的特殊性,在食品、医药、环境保护和包装领域具有极其广泛的应用价值和开发前景[16]。为了更好实现海藻酸及海藻酸盐的应用,对海藻酸及海藻酸盐的生产工艺和开发利用研究显得尤为重要。

目前,国内外提取海藻酸主要采用的是酸凝-酸化法、钙凝-酸化法、钙凝-离子交换法等传统化学工艺提取海藻酸,钙凝-酸化法和酸凝-酸化法均采用酸洗脱盐法。两种工艺都使用了大量的盐酸使得体系环境总体呈酸性,而海藻酸在酸性条件下不稳定,最终导致了产品的质量和产量下降,此外还存在工艺复杂、生产成本高的问题。钙凝-离子交换法与钙凝-酸化法相比,钙析速度快,沉淀易分离,减少了盐酸、碳酸钠等无机试剂的使用,进一步避免了反应过程中海藻酸的降解。由于钠离子交换生成海藻酸钠是可逆反应,因此提高氯化钠的浓度和用量可以提高海藻酸钠的产量,同时也要避免过多的盐对海藻酸钠造成污染[17-18]。近年来出现了采用膜超滤的物理法[19]、采用超声-复合酶降解的生物法[20-21]等新工艺。其中,经过膜分离后的海藻酸和海藻酸盐具有纯度高、色泽好以及粘稠度高的特点。但由于其高粘稠度在进行膜分离的时候极易与膜结合对超滤膜造成污染,使得超滤膜的膜通量和分离效果衰减[20]。酶解法生产海藻酸通常采用纤维素酶代替有机溶液体系浸泡,通过酶解原料的细胞壁从而促进海藻胶的析出,进而提高海藻酸的提取率,缺点是纤维素酶成本较高,酶解效果不佳,无法实现大规模的工业生产[22]。复合酶法作为生物技术在海洋资源转化中应用广泛[23],现有复合酶法生产海藻酸,是在添加纤维素酶的基础上引入其他的多糖酶及蛋白酶,效果上优于单一纤维素酶,同时降低纤维素酶的添加量、减少成本,但提取效率仍有待提高[24]。根据Sun等[25]研究表明海藻酸裂解酶为专一性水解海藻酸的酶,可以高效水解海藻,利用其作为辅助提取海藻酸的工具酶可以有效提升海藻酸的提取效率。

本研究主要目的是在纤维素酶和果胶酶这两种传统多糖酶的基础上引入海藻酸裂解酶,在减少其他酶用量的同时,利用海藻酸裂解酶水解海藻酸的高效水解特性提升海藻酸的提取效率,为海藻酸的绿色提取提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

马尾藻干品:青岛洛安生物科技有限公司;纤维素酶:Solaribo公司,酶活力50 000 U/g;果胶酶:河北润赢生物科技有限公司,酶活力30 000 U/g;海藻酸裂解酶:安徽中弘生物工程有限公司,酶活力100 000 U/g;市售海藻酸复合酶:青岛蔚蓝生物股份有限公司;NaH2PO4、Na2HPO4、CaCl2、Na2CO3、NaOH、HCl,上海国药集团化学试剂有限公司,均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

HK-08B流水式中药粉碎机,旭朗公司;5904-R高速离心机,Sigma公司;WD-9405B型水平摇床,北京市六一仪器厂;PHS-3C pH 计:上海精科仪器有限公司;JY2002电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 马尾藻海藻酸的提取方法

对干燥且藻体完整的马尾藻进行前处理,粉碎机粉碎后过40目筛。马尾藻藻粉与磷酸盐缓冲液按照料液比1∶20(m/v)混合均匀进行酶解,用2% NaOH溶液或者10% HCl溶液调节pH,50 ℃酶解2 h。加入10%的Na2CO3溶液,55 ℃碱消化1 h。8 000 r/min离心5 min后收集上清液,用2% NaOH溶液调节pH至6～7,加入10% CaCl2溶液进行钙析,静置30 min后8 000 r/min离心5 min收集沉淀。沉淀中加入10% HCl溶液酸化2～4 h,形成海藻酸,离心收集沉淀。沉淀中加入蒸馏水进行水洗,8 000 r/min离心5 min重新收集沉淀,放入70 ℃烘箱中烘干24 h,得到白色固体即为海藻酸。提取海藻酸的工艺流程如图2所示,计算公式如式1。

图2 提取海藻酸的工艺流程

(式1)

1.3.2 复合酶法提取海藻酸单因素实验

1.3.2.1 不同酶及酶添加量对海藻酸提取的影响

称量2.00 g前处理后的马尾藻干品粉末,分别加入马尾藻干重1%、2%、4%、6%的纤维素酶,1%、2%、3%、4%的果胶酶,1%、2%、3%、4%的海藻酸裂解酶。按照1∶20的料液比,加入磷酸盐缓冲液,用NaOH和HCl溶液调节pH至5.0,50 ℃酶解2 h后按照1.3.1方法制备海藻酸,计算海藻酸提取率。

1.3.2.2 酶解时间对海藻酸提取的影响

确定纤维素酶、果胶酶和海藻酸裂解酶的添加量为纤维素酶2%、果胶酶3%、海藻酸裂解酶2%。称量2.00 g前处理后的马尾藻干品粉末,按照1∶20的料液比,加入磷酸盐缓冲液,用NaOH和HCl溶液调节pH至 5.0,50 ℃酶解30、60、90、120和150 min后按照1.3.1方法制备海藻酸,计算海藻酸提取率。

1.3.2.3 酶解温度对海藻酸提取的影响

确定纤维素酶、果胶酶和海藻酸裂解酶的添加量为纤维素酶2%、果胶酶3%、海藻酸裂解酶2%。称量2.00 g前处理后的马尾藻干品粉末,按照1∶20的料液比,加入磷酸盐缓冲液,用NaOH和HCl溶液调节pH至 5.0,分别在45、50、55和60 ℃温度条件下酶解2 h后按照1.3.1方法制备海藻酸,计算海藻酸提取率。

1.3.2.4 酶解pH对海藻酸提取的影响

固定纤维素酶、果胶酶和海藻酸裂解酶的添加量,依次为纤维素酶2%、果胶酶3%、海藻酸裂解酶2%,称量2.00 g前处理后的马尾藻干品粉末,按照1∶20的料液比,加入磷酸盐缓冲液,用NaOH和HCl溶液分别将pH调节至3.5、4.5、5.5、6.5的条件下酶解2 h后按照1.3.1方法制备海藻酸,计算海藻酸提取率。

1.3.3 正交实验

通过单因素实验,确定酶添加量、酶提取时间、酶提取温度、pH为影响提取率的4个主要因素,选用纤维素酶∶果胶酶∶海藻酸裂解酶的加酶比(A)、时间(B)、温度(C)、pH(D)4个因素做L9(43)正交表(表1)进行条件优化,确立最优工艺条件。

表1 正交实验因素与水平

1.3.4 3种海藻酸提取方法的对比实验

进行传统化学法海藻酸提取工艺、现有海藻酸提取复合酶产品提取海藻酸和优化复合酶法提取海藻酸的对比实验。

传统工艺称量2.00 g前处理后的马尾藻干品粉末,按照1∶20的料液比,加入磷酸盐缓冲液,用NaOH和HCl溶液调节pH至4.5,55 ℃处理90 min后按照1.3.1方法制备海藻酸,计算海藻酸提取率。

现有复合酶工艺在传统工艺基础上加入海藻酸提取复合酶进行酶解。

优化复合酶工艺在传统工艺基础上按照1.3.3中正交试验确定的最优工艺进行酶解。

1.4 数据处理

每个处理重复3次,取平均值。实验数据采用Excel 2016 软件进行数据分析,Origin Pro 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 酶种类及其添加量对海藻酸提取率的影响

海藻酸提取率随着纤维素酶、果胶酶和海藻酸裂解酶添加量的变化曲线如图3所示。由图3分析可得,当纤维素酶的添加量为2%时海藻酸提取率最高,之后呈下降趋势;随着果胶酶添加量提高,海藻酸提取率呈升高趋势,在果胶酶添加量为 3%之后上升趋势平缓;当海藻酸裂解酶的添加量为2%时海藻酸提取率最高,之后呈下降趋势。

图3 不同酶种类及添加量对海藻酸提取率的影响

纤维酶和果胶酶的酶用量过低时,马尾藻不能完全降解;酶用量过高则会抑制纤维素酶和果胶酶自身对于马尾藻降解反应的进行[25]。对海藻酸裂解酶来说,除上述原因以外,过多的海藻酸裂解酶会降解大分子的海藻酸使得海藻酸损耗率提升,提取率下降。由此根据试验结果,本试验条件下纤维素酶、果胶酶和海藻酸裂解酶的适宜添加量分别为2%、3%和2%。综合考虑,正交试验选择纤维素酶、果胶酶和海藻酸裂解酶3种酶的比例为2∶2∶2、2∶3∶2和3∶3∶2三个水平进行。

2.1.2 酶解时间对海藻酸提取的影响

海藻酸提取率随着酶处理时间变化趋势如图4所示。由图4分析可得,使用纤维素酶、果胶酶和海藻酸裂解酶时,海藻酸提取率都随着时间的延长呈上升趋势。使用纤维素酶提取时,在酶提取时间到达120 min以后,马尾藻的海藻酸提取率无显著变化;使用果胶酶提取时,在经过90 min的酶处理以后,马尾藻中海藻酸的提取率无明显提高,120 min与150 min海藻酸提取率相差不大;使用海藻酸裂解酶提取时,经过90 min的酶处理后,海藻酸提取率提高趋势平稳,在150 min开始略微出现下降趋势。

图4 不同酶种类及时间对海藻酸提取率的影响

同大多数植物细胞一样,纤维素和果胶是组成马尾藻细胞壁的两种主要结构成分,因此,纤维素酶和果胶酶针对纤维素和果胶的降解在酶解马尾藻中起着主要作用[26]。如果酶提取时间太短,酶活力效果没有得到充分发挥;而时间过长又会导致部分酶失去活性,同时,部分大分子的海藻酸也会被海藻酸裂解酶水解导致海藻酸提取率下降。综合考虑经济效益和提取率等各种因素,酶处理时间选择120 min,正交试验时间因素选择90、120和150 min三个水平进行。

2.1.3 不同酶提取温度对海藻酸提取率的影响

酶提取温度对海藻酸提取率的影响变化曲线如图5所示。由图5分析可得,对于纤维素酶、果胶酶和海藻酸裂解酶3种酶,海藻酸提取率都随着温度变化呈现波动趋势。纤维素酶处理的海藻酸提取率随提取温度的升高呈现先升高后下降的趋势,在温度条件为55 ℃时提取率最高;海藻酸裂解酶处理的海藻酸提取率随提取温度的升高呈现先升高后下降的趋势,温度条件为55 ℃时海藻酸提取率增长幅度逐渐趋于稳定;果胶酶处理的海藻酸提取率随提取温度的升高呈现先升高后下降的趋势,在温度条件为55 ℃时提取率最高。

图5 不同酶种类及温度对海藻酸提取率的影响

酶提取温度过低,酶活力得不到充分的发挥,酶反应不能充分进行就起不到降解马尾藻细胞壁的作用;酶提取温度过高,会导致酶结构变形,酶活性减弱或丧失活性,但适当的高温可以起到破坏马尾藻细胞壁的作用[27]。综合考虑经济效益、反应过程和海藻酸提取率等各种因素,正交试验温度因素选择50、55和60 ℃三个水平进行。

2.1.4 pH对海藻酸提取率的影响

pH对海藻酸提取率的影响变化曲线如图6所示。由图6分析可得,对于纤维素酶、果胶酶和海藻酸裂解酶3种酶,海藻酸提取率都随着pH变化呈现波动趋势。纤维素酶处理的海藻酸提取率随着pH变化呈现先上升后下降的趋势, pH为4.5时海藻酸提取率最高;果胶酶处理的海藻酸提取率随着pH变化呈现先上升后下降的趋势, pH为4.5时海藻酸提取率最高;对于海藻酸裂解酶处理的海藻酸提取率随着pH变化呈现先上升后下降的趋势, pH为5.5时海藻酸提取率最高,随后趋于稳定。

图6 不同酶种类及pH对海藻酸提取率的影响

改变酶解pH 会影响酶的稳定性、酶分子与底物的结合状况以及基团的解离状况等[28],同时适当的酸性环境有助于马尾藻细胞壁的降解,提高海藻酸的释放率,从而影响酶解反应。综合考虑经济效益、反应过程和海藻酸提取率等各种因素,正交试验选择pH 4.5、5.0和5.5三个水平进行。

2.2 正交实验结果分析及条件优化

正交实验结果见表2。由表中数据可得,A:加酶比、B:时间、C:温度和D:pH四个因素对海藻酸提取率的影响由大到小分别为:B>A>D>C,即提取时间对海藻酸提取率影响最大,其次是加酶比例、pH和酶提取温度,较优水平组合为B1A1C2D1,即2%的纤维素酶(马尾藻干重)、2%的果胶酶(马尾藻干重)、2%的海藻酸裂解酶(马尾藻干重)、酶提取时间为90 min、酶提取温度为55 ℃、pH 4.5,海藻酸提取率最高。

表2 正交实验及结果L9(43)

2.3 验证结果

根据正交试验结果对最优条件经行验证。2%的纤维素酶(马尾藻干重)、2%的果胶酶(马尾藻干重)、2%的海藻酸裂解酶(马尾藻干重)、酶提取时间为90 min、酶提取温度为55 ℃、pH 4.5,重复3次,测得条件下马尾藻中海藻酸的平均提取率为25.44%,该优化条件为最优条件。

2.4 传统提取工艺、市售海藻酸复合酶与优化复合酶提取对比实验

传统工艺、市售复合酶产品和优化复合酶法工艺产海藻酸提取率如图7所示。其中传统工艺海藻酸提取率为9.67%,现有复合酶产品海藻酸提取率在21.33%,优化复合酶工艺海藻酸提取率在25.44%。由此看见,由纤维素酶、果胶酶和海藻酸裂解酶组成的复合酶体系,在酶提取温度55 ℃、pH 4.5和酶提取时间90 min的条件下可以对海藻酸实现有效的提取。

图7 不同提取方式的海藻酸提取率

3 结论

本研究着重探讨了纤维素酶、果胶酶和海藻酸裂解酶组成的复合酶体系提取海藻酸及其工艺优化,最终确定了2%的纤维素酶、2%的果胶酶和2%的海藻酸裂解酶,按照1∶20的料液比,pH 4.5,55 ℃酶解90 min的酶解体系及工艺条件,在此工艺条件下,海藻酸提取率达(25.43±0.28)%。本研究在传统工艺与单一酶工艺和简单复合酶工艺应用传统多糖酶的基础上,引入海藻酸裂解酶,海藻酸提取效果得到明显的改善,海藻酸提取率高于比单一酶提取法,除此之外,复合酶降解法相对于传统化学法提高了163%,提高酶解效率的同时节省化学法中试剂的用量,改善海藻酸产品的品质,是环境友好型的理想手段,为开展新的复合酶体系拓宽了思路,也为早日实现酶法工业化生产海藻酸奠定了基础。