王子维 李伟缘 张琦 刘奇

关键词：水生生物；增殖放流；微卫星DNA标记；效果评估

伴随着海洋工程建设、环境污染和过度捕捞，我国近海渔业资源出现衰退，甚至一些种类面临枯竭，渔获物明显呈现出低龄化、小型化和低值化［1］。以分布在我国渤海的小黄鱼（Larimichthys polyactis） 为例，其资源量显著减少，群体特征也发生了显著变化。如在1960年，捕获到的小黄鱼平均体长为205.8 mm，到2003年仅为130.3 mm，平均体长呈现出下降趋势。对年龄组成分析也发现，1960年小黄鱼渔获物年龄范围为1～21龄，自1993年开始仅为1～2龄，目前所捕获到的小黄鱼以一龄鱼甚至年龄更小的个体居多［2］。

针对渔业资源衰退的现状，国内外相继出台并完善了渔业资源管理制度，旨在利用制度建设来实现渔业资源的可持续发展，这其中包括：渔业权制度、捕捞限额制度、捕捞配额制度和增殖放流行动方案［3］。其中，增殖放流是指将孵化场人工培育的幼体投放到天然水域中，进而补充自然群体，达到缓解渔业资源衰退的目的［4］。增殖放流不仅可以增加水生生物种群数量、捕捞产量，还可以有效地改善水域环境、优化水域群落结构和保持生态平衡［5］。成功的增殖放流活动可以取得明显的经济、生态和社会效益。

依靠增殖放流来增加特定水域渔业资源量的方法已有百年历史。如较早的增殖放流是把自然水域中的亚洲鲤（Cyprinus carpio）投放到另一个特定水域中，以达到引种和增加渔业资源的目的［6］。但伴随水生生物人工繁育技术的突破和不断完善，世界上许多国家相继开展了多种类、大规模的水生生物增殖放流活动，如挪威、日本、美国、中国等。

日本作为开展水生生物增殖放流活动较早的国家之一，早在上世纪60年代初就开始针对洄游路线较固定的鱼类和活动范围较小的贝类开展放流，如真鲷（Pagrus major）和皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）等［7］。之后经过几十年的不断探索和改革，日本沿岸增殖放流不断完善。据有关资料显示，1999年，日本在沿岸海域开展了大规模的增殖放流活动，放流种类多达82种，累计放流数量高达153.01亿尾，这其中主要包括圆斑星鲽（Verasper variegatus）、尖吻黄盖鲽（Pseudopleuronectes herzensteini）和褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）等在内的8种鲆鲽类鱼类［8］。近十余年来，日本多以大规模、持续性的鱼类、甲壳类经济物种增殖放流居多，如真鲷、褐牙鲆和三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）［9-10］。截至目前，有多达30种水生生物的年放流量已超过百万尾（只）以上，一些种类表现出良好的增殖放流效果，如虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）［11］。

美国增殖放流活动始于19世纪后期，其目的是为了恢复因工程建设而遭到破坏的渔业资源量，但前期效果并不显著。进入20世纪， 随着苗种人工繁育技术提高和增殖放流策略的日益完善，增殖放流效果得以提升，渔业资源量也得以恢复［12］。截至目前，美国增殖放流种类超过20种，放流物种主要为经济价值较高的鲑鳟鱼类，如驼背大麻哈鱼（Oncorhynchus gorbuscha）和大马哈鱼（O. keta） ［13］。除此之外，加拿大、挪威、俄罗斯和我国也陆续开展了鲑鳟鱼类的增殖放流工作。

我国真正意义上的水生生物增殖放流活动始于上世纪50年代。随着四大家鱼人工繁育的成功，先后将青鱼（Mylopharyngodon piceus）、草鱼（Ctenopharyngodon idella）、鲢（Hypophthalmichthys molitrix）和鳙（Aristichys nobilis） 等数十种鱼类苗种投入淡水开展增殖放流［14］。而我国近海开展增殖放流活动起步相对较晚，1985年辽宁省率先开展了中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）的增殖放流活動。之后陆续在沿岸各水域根据沿岸生态条件、物种的生物学特性开展了包括鱼类如许氏平鲉（Sebastes schlegelii），甲壳类如三疣梭子蟹，贝类如虾夷扇贝，棘皮动物如刺参（Apostichopus japonicus）等的增殖放流活动［15］。经过几十年的发展，我国增殖放流规模不断扩大，技术不断完善，并取得了显著的成效。据统计，2004—2013年期间，我国累计放流水生生物苗种达2 316.10亿尾，投入资金52.12亿元［16］。2021年，全国共进行增殖放流活动2 700余次，累计放流各类水生生物苗种440.53亿尾。其中，放流梭子蟹、对虾等海洋生物苗种数量达319.93亿尾。

对国内外的增殖放流研究发现，水生生物增殖放流虽然会带来一定经济效益，但存在的一些问题不容忽视，如放流与野生种群竞争加剧、破坏固有野生种群遗传结构等［17-18］。因此，对水生生物增殖放流后的整体效果评估显得尤为重要。

1 分子标记种类及其应用

1.1 分子标记的种类

随着水生生物增殖放流活动在世界范围的规模化开展，仅仅通过放流数量和渔业产量的关系来评估增殖效果显然是不合理的。自20世纪80年代以来，随着分子生物学的迅猛发展，分子标记被广泛应用于个体识别和种群特征解析［19］。因其不受外界环境和发育阶段的影响，能从DNA水平上直接反映出基因组的变化差异，并克服传统标志方法对水生生物机体的损伤，现已成为评估增殖放流效果的有效标记手段［20-21］。

分子标记一般是指以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映［22］。分子标记方法主要有随机扩增多态性DNA（RAPD）、限制性酶切片段长度多态性（RFLP）、扩增片段长度多态性（AFLP）、简单重复序列（SSR） ，即微卫星DNA（Microsatellites DNA）以及单核苷酸多态性（SNP）等标记。而微卫星DNA标记在目前水生生物增殖放流效果评估中应用较为广泛。

1.2 微卫星DNA标记

微卫星DNA标记，具有含量丰富，多态性高，片段较小，在基因组中分布均匀，杂合度高，且重复性好，测序结果稳定，对DNA模板要求低；此外也属于共显性遗传标记，有益于个体识别。基于微卫星DNA标记，经亲缘关系分析，能准确的区分开放流群体和野生群体，并以此来估算回捕率或放流群体占总回捕群体的比例（重捕比例），从而有效掌握增殖放流效果。另一方面，在增殖放流监测过程中，利用微卫星DNA标记可以同时开展放流群体遗传多样性和适应性等相关研究，可以较全面、有效地评估水生生物增殖放流效果［23］。

1.2.1 微卫星DNA标记在回捕调查中的应用 近年来，微卫星DNA标记在水生生物增殖放流回捕率或重捕比例评估中的应用案例逐渐增多。早期Sekino等［24］利用4个微卫星位点，并以线粒体DNA测序分析作为辅助手段对褐牙鲆放流群体进行回捕分析，最终从149尾回捕群体中成功地识别出35尾为当年放流个体。Jeong等［25］利用5对高多态性的微卫星DNA标记对2001年日本广岛湾黑鲷 （Acanthopagrus schlegelii） 放流群体进行回捕调查，经亲子鉴定发现，在199尾回捕群体中有117尾为当年放流个体，即放流群体占总回捕群体的比例为58.8%。Liu等［26］在2015年辽东湾盘锦海域三疣梭子蟹增殖放流效果评估中，使用6对高多态性的微卫星DNA标记对50只繁殖亲蟹和1 671只回捕蟹群体开展亲子鉴定，以探究放流群体对野生群体的资源贡献率，结果显示，回捕群体中有120只为当年放流蟹，1 551只为野生个体，即重捕比例为7.2%。刘胜男等［27］利用9对多态性较高、稳定性较好的微卫星DNA标记对2017年5月我国在北部湾东兴附近海域放流的长毛对虾（P. penicillatus）進行效果评估中，于2017年9月至2018年2月逐月开展回捕，基于亲子关系分析，发现在回捕到的517尾长毛对虾中，有202尾为当年放流个体，放流个体占回捕个体的比例为39.07%。月间回捕比例（当月回捕到的放流个体占月回捕总数的比例）在25%～57%之间。大量研究发现，利用多态性高、稳定性好的微卫星DNA标记对回捕群体开展放流个体识别可以取得可靠效果，相较于SNP标记，使用微卫星DNA标记开展个体识别的测序成本较低，适用于在大规模增殖放流中使用。

1.2.2 微卫星DNA标记在增殖放流遗传学评估中的应用 负责任的增殖放流模式应保障人工放流群体的遗传多样性，遗传结构的稳定，从而减少人工放流对野生群体的遗传影响［28］。因此，在增殖放流过程中开展遗传学评估显得尤为重要。An等［29］在韩国沿海地区进行花鲈（Lateolabrax maculatus）增殖放流活动前，利用12个高多态性的微卫星位点评估了养殖种群和野生种群之间的遗传多样性，结果显示两种群均具有较高的遗传多样性。Liu等［30］对我国渤海海域褐牙鲆的增殖放流效果进行了评估，利用8对高多态性的微卫星DNA标记对繁殖亲本群体和回捕群体开展基因型分析，并基于亲子鉴定技术，最终成功地区分开回捕群体中放流群体与野生群体。在对两群体进行遗传分析时发现，放流群体和野生群体间的平均观测杂合度（Ho）和平均期望杂合度（He）无显著差异 （P>0.05） ，表明放流群体在放流后维持了较高的遗传多样性，对野生群体的遗传多样性暂未产生负面影响。Wang等［31］通过7个高多态性的微卫星位点对我国南海大亚湾海域放流的黑鲷种群进行分析调查，最终成功地在回捕群体中识别出当年放流个体。然而，在对放流前后各群体的遗传多样性分析发现，回捕群体的平均等位基因丰度（Ar）、平均观测杂合度（Ho）、平均期望杂合度（He）较放流前采集的野生群体均有所降低，暗示此次的增殖放流活动可能会对野生群体的遗传多样性产生一定负面影响。

1.2.3 微卫星DNA标记在放流群体适应性评估中的应用 人工繁育苗种生长环境不同于野生群体，栖息地环境的差异容易造成对环境的适应性出现一定的分化。在水生生物增殖放流过程中，有必要从生长状况和摄食生态这两方面对人工放流群体在自然水域中的适应性进行评估。Wang等［32］在我国渤海海域褐牙鲆增殖放流过程中，通过形态学比较、线粒体DNA （mtDNA） 和微卫星DNA标记分析，成功地区分开放流群体与野生群体，在比较两群体全长、体质量 、肥满度 、鱼体脂质水平 和胃含物指数差异时发现，两群体间均无显著差异（P>0.05），且摄食均以鱼类为主，因此可以推论放流群体能适应自然水域环境。Liu等［23］利用9对高多态性的微卫星DNA标记对2019年我国黄海北部海域许氏平鲉放流效果进行评估，经亲子鉴定，成功地从710尾回捕个体中识别出279尾为当年放流个体，在对放流群体与野生群体生长状况、摄食生态情况分析时发现，两群体间个别形态学参数存在显著差异（P<0.05），表现为放流个体体型似乎更大、尤其头部部位，此外放流群体的腹鳍更小；而摄食参数评估表明放流群体已经能够适应放流区的野生环境，摄食情况与野生群体无明显差异（P>0.05） 。

2 对增殖放流策略及放流效果评估的建议

前期研究表明，增殖放流虽能在一定程度上达到补充原有资源量的目的，但有时也可能给放流水域野生种群带来负面的遗传影响或生态影响。因此，增殖放流过程的每一阶段都应做好科学规划，使增殖放流的经济效果最大化，减少负面的遗传和生态影响，使人工增殖放流达到预期的效果。

参考国内外成功的放流案例，笔者建议，在接下来的增殖放流工作中，应着重把握如下关键点：

2.1 制定科学、合理的放流策略

在开展增殖放流前应充分考量放流后苗种的存活率、饵料来源以及是否会对野生群体造成负面的生态或遗传影响［33］。故放流前进行放流水域实地调研是必要的，选取适宜的放流水域和放流时间，确保饵料充足。此外，因放流承担单位开展苗种繁育的方式不尽相同，对苗种质量缺乏全面监控，很可能造成一些携带疾病的苗种放流到自然水域中，造成负面的生态影响［34］。故对放流苗种质量进行全面有效的监控是必要的，应选择健康、体格健壮的苗种予以放流，以保证放流后的存活率和减少对野生群体的影响。

2.2 积极开展放流水域生态环境的保护

若放流水域生态环境恶化，会加大水生生物资源修复难度，致使增殖放流无法达到预期效果。因此，开展放流水域的生态环境保护是目前不容忽视的问题。笔者建议应加强工业污水和养殖废水排放的管理，避免过多的工业污水和养殖废水将携带的有害物质排入放流水域，造成水体污染，严重时会导致放流水域苗种的死亡，很可能会抑制增殖放流效果。此外应对主要放流水域设立一定范围的禁渔区，打击对放流早期苗种的偷捕行为，从而保障放流苗种的存活和生长 。

2.3 完善增殖放流效果評估体系

对放流水域进行回捕调查时，应充分考虑放流苗种的生活习性，对分布范围较广的渔业调查对象，可通过扩大调查水域面积的方式进行放流效果评估，从而使获得的回捕率或重捕比例评估更加准确。此外在开展增殖放流效果评估时，对放流群体和野生群体开展遗传学评估也是非常必要的，有助于有效避免负面的遗传效应。

3 结语

增殖放流对维持生态平衡和增加渔业产值有着重要作用，但如何更好地开展水生生物增殖放流活动值得我们深入思考，笔者结合国内外水生生物增殖放流研究的最新进展及我国水生生物增殖放流的实际情况，以目前常用的微卫星DNA标记技术为切入点，介绍了该技术在个体识别、遗传多样性及适应性评估中的应用。同时结合多年的增殖放流理论与实践，对水生生物增殖放流策略和效果评估提出若干建议，旨在为目前开展的水生生物增殖放流提供科学、有益的理论参考。

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Stock enhancement of aquatic organism and application of microsatellite DNA marker in stock enhancement

WANG Ziwei1 ， LI Weiyuan1， ZHANG Qi1， LIU Qi2

（1.College of Fisheries and Life Science， Dalian Ocean University， Dalian 116023， China;2.College of Marine Science and Environment， Dalian Ocean University， Dalian 116023， China）

Abstract：Taking microsatellite DNA marker technology as an example， the application of the technology in individual identification， genetic diversity and adaptability evaluation in the process of stock enhancement was systematically expounded. At the same time， suggestions on the strategy and effect evaluation of aquatic organism stock enhancement were also put forward.

Key words：aquatic organism; stock enhancement; microsatellite DNA marker; effect evaluation

（收稿日期：2022-08-10）