基于ISSR分子标记的44种山药种质资源遗传多样性分析

2023-05-30陈阳周先治马丽娜兰准柄

福建农业科技 2023年2期

陈阳周先治马丽娜兰准柄

摘要：为探讨不同地区山药种质资源类型及遗传多样性亲缘关系，为山药品种选育、种质资源的保护利用提供参考。采用ISSR标记技术对44份山药种质资源进行遗传多样性及聚类分析。结果表明：从100条随机引物中筛选出8条随机引物，8条引物扩增获得的总谱带数为87条，多态性谱带数为87条，多态性谱带比例为100%。聚类分析将44份种质资源分成 4 个类群，从结果看ISSR标记技术聚类分析与植物分类学进行的基原分类结果基本一致，44份山药种质资源的遗传距离在0.0313～0.7216，以遗传距离为0.5618进行划分，可以将44份山药种质资源划分为5类，其中薯蓣与褐苞薯蓣亲缘关系最近，与山薯较远，与参薯距离最远。

关键词：山药；种质资源；ISSR标记技术；遗传多样性

中图分类号：S 632.1 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2023）02-0001-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.02.001

Abstract： In order to explore the types of yam germplasm resources and the genetic relationship of their genetic diversity in different regions， and provide reference for the breeding of Chinese yam varieties and the protection and utilization of germplasm resources， the genetic diversity and cluster analysis of 44 germplasm resources of Chinese yam were carried out by ISSR marker technique. The results showed that the 8 arbitrary primers were screened from 100 arbitrary primers， and the total number of bands amplified by 8 primers was 87， the number of polymorphic bands was 87， and the proportion of polymorphic bands was 100%. The cluster analysis divided the 44 germplasm resources into four class groups. The results of the cluster analysis by ISSR marker technique were basically consistent with the original classification results of plant taxonomy. The genetic distance of the 44 yam germplasm resources ranged from 0.0313 to 0.7216. According to the genetic distance of 0.5618， the 44 germplasm resources of yam could be divided into 5 categories. Among them， the genetic relationship between Dioscorea opposita and Dioscorea persimilis was the closest， which was far from Dioscorea opposita and the farthest from Dioscorea opposita.

Key words： Yam； Germplasm resource； ISSR marker technique； Genetic diversity

山药Dioscoreaopposita為薯蓣科Dioscoreaceae、薯蓣属DioscoreaL.植物，一年或多年生缠绕性藤本植物[1-3]。山药肉质细腻，风味鲜美，既可供人们食用，又具有增强人体免疫能力、健脾益胃、延缓衰老、抑制肿瘤、抗氧化活性等作用，是药、菜、粮兼用的特色农产品[4-13]。山药种类繁多，裴鉴[14]在《中国植物志》中将山药及其相近种分为薯蓣、参薯、山薯、褐苞薯蓣、日本薯蓣。目前在我国大面积栽培种主要有薯蓣、参薯、褐苞薯蓣、山薯等4种薯蓣属植物，其中薯蓣主产在我国北方地区，参薯、褐苞薯蓣、山薯主产在我国南方地区。由于各地区山药种质资源在品种特性及地域分布存在较大差异，导致当前生产上种植的山药品种较为杂乱，不利于引种及品种遗传改良。

近年来，随着分子生物学技术的发展，DNA 分子标记已广泛应用于山药遗传多样性和品种选育研究。目前，国内外许多学者利用各种手段对山药种质资源进行了收集、保存、分类、鉴定和保护利用，其中形态学标记和DNA分子标记是研究山药遗传多样性和品种分类的主要方法[15]。周延清等[16]利用ISSR标记技术分析了28个山药品种的遗传多样性，多态性比率为 83.01%，将28个山药品种划分为4组。华树妹等[17]采用 RAPD标记技术将福建山药资源聚类分为4类，通过分子标记能将参薯和普通山药分开。我国山药种质资源分布广泛，地理分布存在较大差异，分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，DNA分子标记应用于山药种质资源的遗传多样性研究，显示出强大的优势。为了更准确地了解山药种质资源类型及亲缘关系，本研究采用ISSR标记技术对来自全国不同地区的44份山药资源进行遗传多样性聚类分析，探讨山药栽培种薯蓣、参薯、褐苞薯蓣、山薯之间亲缘关系的远近，以期为山药资源分类鉴定、新品种的选育、种质资源的保护利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

2022年收集河北省、河南省、湖南省、湖北省、广东省、福建省等地区的地方主栽山药种质资源，共 44 份。其中包括 9份薯蓣Dioscoreaopposita Thunb、 9 份褐苞薯蓣Dioscoreapersimilis Prain et Burkill、2份山薯DioscoreafordiiPrain et Burkill和 24 份参薯Dioscoreaalata L.。材料的编号及来源地见表1。

1.2 主要试剂

本试验所用的100条随机引物（编号为S801～S900）和M5CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司，琼脂糖、Rnase酶、PremixTaq酶等试剂均购自鼎国生物。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计试验于2022年4月在德化县龙浔镇英山村山药基地进行。 44份山药种质资源按当地常规立架栽培进行种植管理，定期观察记载。

1.3.2 山药种质资源农艺性状调查每个山药种质资源在伸蔓期采摘植株嫩叶部位作为DNA提取材料。在生长旺盛期，调查不同类别山药种质资源生长势、叶形、叶色、茎蔓形状、零余子、开花情况；收获时调查不同类别山药种质资源块茎形状、薯皮颜色、薯块肉色。

1.4 山药种质资源基因组总DNA的提取

按照基因组试剂盒说明方法提取总DNA。ISSRPCR反应体系为：94℃预变性5 min，94℃变性60 s，30～60℃退火45 s，72℃延伸90 s，35个循环，72℃延伸10 min，10℃保存30 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像并保存。

1.5 扩增产物的分离与记录

根据凝胶电泳显示结果，按照扩增产物条带的有无进行统计，在同一位置上有扩增条带的记为“1”，无扩增条带为“0”，把所有样品共有的位点记为无多态性位点，其余的均为多态性位点，将各引物的扩增结果进行记录，建立所有位点的二元数据。

1.6 统计分析

聚类分析采用DPS 7.05软件进行，种质间遗传距离采用UPGMA法聚类分析，构建遗传关系系统树。

2 结果与分析

2.1 44份山药种质资源形态特征分析

由表2可知，同一山药资源类群基本上具有相同性状特征，其中薯蓣类群山药种质资源主要特征为：植株生长势中等或较弱，叶片较小，叶形为戟形，具零余子，大多开花，地下块茎为长圆柱形，肉色为白色，表皮较光滑，单株块茎质量较小；褐苞薯蓣类群山药种质资源主要特征为：植株生长势较强或中等，叶片中等大小，叶形为心形，叶脉颜色较深，基本无零余子，部分开花，地下块茎为圆柱形，薯皮颜色呈黑褐色或黄褐色，薯肉颜色为白色；山薯类群山药种质资源主要特征为：植株生长势较强，叶片中大型，叶形卵形或心形，具零余子，不开花，地下块茎为圆柱形或棒状，薯皮颜色呈褐色或灰褐色，薯肉颜色为白色；参薯类群山药种质资源主要特征为：植株生长势普遍较强，叶片较大，叶形为卵形或心形，无零子，基本不开花，茎蔓有棱翼，薯皮颜色为褐色、黄褐色、紫红色，薯肉颜色较丰富，有紫色、紫红色、紫白色、白色等，块茎形状各异，有圆柱、脚板状、扁平状等诸多形状，块茎质量普遍较大。

2.2 44份山药种质资源ISSR引物扩增结果

由表3可知，采用ISSRPCR反应体系对100条随机引物进行了扩增反应，筛选出条带清晰，多态性丰富，稳定性较高的引物8条，各引物扩增出8～14条带，其中S817扩增的条带数最多，为14条，8条引物的总扩增条带数为87条，多态性条带数为87条，多态比例达100%。

2.3 44份山药种质资源遗传多样性分析

根据44个山药资源ISSRPCR扩增结果，其中引物S807对44个山药品种的ISSR扩增结果见图1。利用DPS软件各山药资源遗传距离用UPGMA法聚类分析，统计各山药资源间的遗传相似系数，建立44份山药种质资源的遗传关系树状见图2。

由图2可知，44份山药种质资源的遗传距离在0.0313～0.7216，当遗传距离越近，表明种质资源亲缘关系越近，遗传距离越远，表明种质资源亲缘关系越远。本研究遗传距离最远为0.7216，说明44份山药种质资源遗传差异较大，其中编号23和24的山药遗传距离为0，说明这两种山药种质资源很有可能为同物异名。

以遗传距离为0.5618进行划分，可以将44份山药种质资源划分为5类，第1类有30个品种，编号为1、4、31、2、23、24、33、36、37、40、44、43、41、8、10、19、20、22、6、9、11、13、27、12、21、18，28、34、35、29，这30个品种主要来自河北、河南、山东、福建、廣西和广东等地，从植物学分类看包含所有类别的山药种质资源；第2类包括1个品种，编号为16，这个品种来自广西南宁；第3类包括9个品种，编号为3、5、14、15、17、25、26、32、38，9个品种主要来自广西、湖南、福建等地；第4类包括3个品种30、39、42，这3个品种分别来自广西、广东和福建；第5类包括1个品种，编号为7，这个品种来自湖南邵阳。从植物学分类看，第2类至第5类均为参薯类群。

以遗传距离为0.3646进行划分，第一大类可划分成为5个亚类，其中第1、2亚类含1、4、31、2等在内的18份山药种质资源，这些山药种质资源全部为薯蓣类群及褐苞薯蓣类群，从遗传距离看薯蓣类群遗传距离在0.0313～0.2353，褐苞薯蓣类群遗传距离在0.1111～0.2536；第3、4、5亚类含6、9、11、13等在内12份山药种质资源，这些山药种质资源为山薯类群及参薯类群。从试验结果可以看出，ISSR聚类分析将44份山药资源分成 4 个类群，即薯蓣类群、褐苞薯蓣类群、山薯类群、参薯类群，聚类分析结果与植物分类学进行的基原分类结果基本一致。

3 讨论与结论

ISSR分子技術具有多态性丰富、稳定性好、操作方便及成本低等优点[18]。本研究采用ISSRPCR反应体系，对100条随机引物进行了扩增反应。从筛选的结果来看，筛选出条带清晰，多态性丰富，稳定性较高的引物8条，各引物扩增出8～14条带，说明山药各种质资源间具有相当高的ISSR位点，筛选44个山药种质资源DNA标记多态性比例都为100%。44份山药资源中有9份资源为薯蓣类，分布在河南、河北、山东等3个省区，可以看出北方地区栽培的山药类群主要以为薯蓣类群为主；9份资源为褐苞薯蓣、2份资源为山薯，全部分布在福建，24份资源为参薯类，分布在福建、湖南、江西、广东、广西等地，可以看出南方地区栽培的山药类群主要为参薯类群、褐苞薯蓣类群、山薯类群。

本研究结果显示ISSR聚类分析将44份山药种质资源分成 4 个类群，即薯蓣类群，褐苞薯蓣类群、山薯类群、参薯类群，聚类分析结果与植物分类学进行的基原分类结果基本一致。44份山药种质资源的遗传距离在0.0313～0.7200，说明山药种质资源间的亲缘关系较为复杂。其中薯蓣类资源遗传距离在0.0313～0.2353，褐苞薯蓣资源遗传距离在0.1111～0.2536，山薯资源遗传距离在0.2929～0.3475，参薯资源遗传距离在0.2861～0.7216，说明薯蓣与褐苞薯蓣亲缘关系最近，与山薯较远，与参薯距离最远。从植物学形态特征上看，薯蓣与褐苞薯蓣具有许多共同点，山药块茎都为长棒形，肉色白色，块茎外观较为相似；薯蓣、褐苞薯蓣在植物学形态特征上与参薯差异较大。试验结果说明ISSR聚类分析能将具有相近亲缘关系、相似形态类型的山药种质资源聚在一起，能反映不同种质资源遗传类型的差异。

本结论与李丽红等[19]的研究结果参薯类群与山薯类群较近，与薯蓣类群和褐苞薯蓣类群较远结论吻合，与张武君等[20]的研究中薯蓣和山薯先聚为一类，再和褐苞薯蓣聚为一类，参薯的遗传距离最远，有所差异，而与黄玉仙等[21]的研究山薯与褐苞薯蓣亲缘关系最近，与薯蓣较远，与参薯最远结论有较大差别。今后本研究还将继续收集不同地区山药资源，对不同类群山药亲缘关系做进一步的研究，以求获得更全面、更准确的分析结果。

参考文献：

[1]郑玉红，夏冰，杭悦宇，等.山药原植物薯蓣及其近缘种的分子鉴别和亲缘关系研究[J].南京农业大学学报，2007，30（2）：55-59.

[2]聂凌鸿，宁正祥.山药的开发利用[J].中国野生植物源，2002，21（5）：17-19.

[3]韦本辉，甘秀芹，韦威旭，等.不同淮山药品种（种质）资源营养特性与聚类分析[J].广西农业科学，2008，39（5）：596-600.

[4]华树妹，周以飞，涂前程，等.福建山药种质资源遗传多样性的RAPD分析[J].三明农业科技，2008（2）：12-15.

[5]殷剑美，闫瑞霞，韩晓勇，等.秸秆套网袋栽培对紫山药产量及品质的影响[J].浙江农业学报，2014，26（1）：61-66.

[6]李齐向，华树妹，雷伏贵，等.ISSR和SRAP在山药遗传多样性分析上的应用比较[J].福建农业学报，2013，28（9）：876-883.

[7]蔡金辉，严渐子，黄晓辉，等.山药品种资源的分类研究[J].江西农业大学学报1999，21（1）：53-57.

[8]邱珊莲，王伟英，张少平，等.福建武平参薯与其同属植物山药中营养成分的比较分析[J].热带作物学报，2014，35（11）：2307-2311.

[9]雷伏贵，华树妹，涂前程，等.山药种质资源亲缘关系的ISSR分析[J].三明农业科技，2013（1）：4-7.

[10]李霄，倪泽存，吴岳，等.不同山药资源引进种植比较试验[J].黑龙江农业科学，2016（1）：129-131.

[11]宋君柳.山药品种资源及化学成分研究进展[J].长江蔬菜，2009（6）：1-5.