王弋　付灯恩　董晨　郑雪文　李伟才

关键词：荔枝；LcSMXL7；分枝；独脚金内酯；生物信息学

中图分类号：S667.1 文献标识码：A

独脚金内酯（strigolactones， SLs）属于倍半萜烯型化合物，是一类新型植物激素[1-2]。1966 年，COOK 等[3]最先在棉花根系分泌物中发现一种可在激素水平可诱导独脚金种子萌发的物质，此后BUTLER[1]根据该物质的功能特点将其命名为独脚金内酯。除了诱导独脚金种子萌发，独脚金内酯还可促进与植物根系共生的丛枝菌根真菌的菌丝分枝形成[4]。近年来的研究表明独脚金内酯可作为信号物质在植物体内移动并抑制植物侧枝的形成[5-6]。

随着不同物种中一系列独脚金内酯不敏感突变体的鉴定，独脚金内酯信号转导途经的重要组分也相继被克隆[7-10]。进一步通过遗传、生化及酶学分析，科学家发现独脚金内酯具有独特的信号转导过程[11-14]。目前的研究结果表明独脚金内酯信号具有“底物－酶－配体－受体”这一植物激素识别新机制，独脚金内酯受体AtD14 既可作为酶催化SL 的水解反应，又可作为受体感知SL信号[13]。独脚金内酯被受体AtD14 识别并被AtD14 催化中心水解为活性分子CLIM，之后AtD14 与CLIM 发生共价结合诱导AtD14 蛋白构象发生转变并与F-box 蛋白MAX2结合，形成SCF复合体[11-12]，诱导D53/SMXL 发生泛素化修饰介导的蛋白降解，从而抑制植物分枝[12]。D53/SMXL作为独脚金内酯的重要组分，被认为是具有抑制子和转录因子双重功能的新型抑制子，可通过直接结合DNA 调控基因的表达。拟南芥中，过表达SMXL6/7/8 可显著增加分枝数[14-15]。

研究表明，荔枝花穗分枝数量与花量密切相关，分枝数量多对应的花量也大，但目前对荔枝花穗分枝发育机制的研究较少。为了明确荔枝花穗发育的分子机制，鉴定参与荔枝花穗分枝调控的基因，本研究以分枝调控因子LcSMXL7 为研究对象，通过生物信息学分析、组织特异性表达及异源转基因等研究明確其功能，并为开发荔枝花穗分枝调控技术提供基因资源。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究于2020年开展，荔枝（Litchi chinensisSonn.）材料来自南亚热带作物研究所荔枝试验基地。选取12 a 树龄、树势健壮的‘妃子笑/黑叶砧穗组合荔枝结果树。拟南芥Col-0 用于分析LcSMXL7 功能（拟南芥研究中标准的野生型）[16]，本氏烟草用于分析亚细胞定位。

1.2 方法

1.2.1 LcSMXL7 生物信息学分析 利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）的OpenReading Frame Finder 在线软件分析LcSMXL7 的开放阅读框及编码蛋白。蛋白生理生化性质利用在线网站ExPAsy 站点工具Protparam 分析。利用MEGA 6 软件中的Neighbor-joining 工具构建LcSMXL7 蛋白序列的系统发育树，Bootrap 检验的重复值设置为1000。

1.2.2 LcSMXL7 的克隆及过表达载体构建 利用SDS/酚法提取荔枝总RNA，利用全式金公司的TransScript One-Step RT-PCR SuperMix 试剂盒合成cDNA 第一链。基于RNA-seq 获得的LcSMXL7序列设计引物，上游引物为LcSMXL7F：TcatttggagaggacagggtacccATGGAACTGGGTTCAGGCTC，下游引物为LcSMXL7R：AGGTCGACTCTAGAGGATCCCCTTAAAGTGACCAGTTCATC。将PCR产物进行电泳，切下目的条带后利用全式金Easy-Pure? Quick Gel Extraction Kit 试剂盒进行胶回收。随后利用全式金公司pEASY-Uni SeamlessCloning and Assembly Kit 试剂盒，将片段克隆至pCAMBIA2300 载体，获得过表达载体。

1.2.3 荧光定量PCR 分析 利用SDS/酚法提取荔枝根、茎、叶、花、果皮等部位总RNA，利用全式金公司的TransScript One-Step RT-PCR SuperMix试剂盒合成cDNA 第一链。荧光定量PCR引物为LcSMXL7RTF：GGAACGGGCTCATCATCAAC，LcSMXL7RTR：TGAAGGCCAGCAACAATGAC。内参所用引物为LcActinF：AGTTTGGTTGATGTGGGAGAC，LcActinR：TGGCTGAACCCGAGATGAT。

1.2.4 亚细胞定位 亚细胞定位载体构建所用引物为LcSMXL7GFPF：tcatttggagaggacagggtaccc-ATGCCTACGCCGGTAGCCG，LcSMXL7GFPR：CTCACCATTCTAGAGGATCCCCAACTCAGGACGATTTTTGG，去除终止子密码子。采用化学转化法将已构建好的pCAMBIA2300-Lc-SMXL7-GFP 载体转入农杆菌，随后将农杆菌侵染本氏烟草叶片。3 d 后剪下叶片侵染区域并置于于激光共聚焦下观察荧光信号。

2 结果与分析

2.1 LcSMXL7 的基因序列及理化特性分析

利用RNA-seq 的注释结果（NCBI 序列号为SRX2336010），分析SUPPRESSOR OF MAX21-LIKE 7（SMXL7）基因家族成员，鉴定到一个LcSMXL7 成员。该基因CDS 长度为3408 bp，编码1135 个氨基酸；SMXL7 具有2 个Clp 结构域和1 个AAA_2 结构域（图1）。Clp 结构域具有分子伴侣功能，AAA_2 结构域是ATP 的结合和水解位点，具有ATPase 活性。

理化性质分析表明，LcSMXL7 的分子式为C5429H8632N1530O1715S38，理论相对分子质量（Mw）为123.99 kDa。理论等电点（pI）约为5.96，其中带负电荷的氨基酸残基（Asp + Glu）137 个，占总数的12.1%，带正电荷的氨基酸残基（Arg +Lys）122 个，占总数的10.8%。LcSMXL 蛋白脂溶指数为83.74，亲水性平均系数为-0.305，说明其为亲水性脂溶蛋白。该蛋白的蛋白不稳定指数为46.38，说明其稳定性较低。

2.2 LcSMXL7 组织表达特异性分析

qRT-PCR 分析结果表明，在各个组织和器官中均可检测到LcSMXL7 表达，但表达水平存在一定差异，其中在茎和种子中表达水平较高，其次为叶片、花穗、雄花和果皮，而在雌花、果肉和根中的表达水平较低（图2）。分析结果说明该基因可能在茎和种子中起到重要作用，这与独脚金内酯参与调控拟南芥分枝和种子萌发的研究结论相一致。

2.3 LcSMXL7 系统发育树分析

在NCBI 数据库中下载甜橙[Citrus sinensis（L.） Osbeck]、杧果（Mangifera indica L.）、锦葵（Herrania umbratica）、可可（Theobroma cacao）、榴莲（Durio zibethinus Murr.）、木本棉（Gossypiumarboreum Linn.）、木槿（Hibiscus syriacus Linn.）、普通核桃（Juglans regia L.）、白栎（Quercus lobataHance.）、毛果杨（Populus trichocarpa Phr.）、麻风树（Jatropha curcas L.）、蓖麻（Ricinus communis）、橡胶树（ Hevea brasiliensis） 及木薯（Manihot esculenta Crantz.）等物种的SMXL7 蛋白序列。对不同物种的SMXL7 蛋白序列作系统发育树的分析的结果显示，LcSMXL7 与来自木本果树甜橙和杧果的SMXL7 蛋白序列聚类在同一个分支，而来自其他14 个物种的LcSMXL7 蛋白序列聚类在其他分支（图3）。表明LcSMXL7 与来自甜橙和杧果的SMXL7 蛋白具有较近的进化关系，而与其他物种SMXL7 蛋白进化关系较远。推测LcSMXL7 与甜橙和杧果的SMXL7 具有相似功能。

2.4 LcSMXL7 促进植物分枝分析

为了明确荔枝LcSMXL7 的基因功能，将该基因通过农杆菌介导的遗传转化法转化拟南芥并获得T1 代转基因种子。利用T1 代种子进行卡纳霉素抗性实验，卡方检验分析表明所选的转基因株系后代的抗性/无抗性植株均符合3∶1 的分离比，表明所选株系均为单拷贝株系。在获得T3 代单拷贝稳定基因植株后对其功能进行分析。结果如图4 所示，相比野生型，转基因拟南芥分枝数量显著增多，分枝平均数量由野生型植株的1.5 个提高到转基因植株的5.07 个，而株高并无显著变化。该结果表明过表达LcSMXL7 可显著提高拟南芥的分枝数量，即LcSMXL7 可促进南芥分枝发育。

2.5 LcSMXL7 蛋白的亚细胞定位分析

LcSMXL7作为一个SQUAMOSA-pROMOTERBINDING PROTEIN 类型蛋白，被预测作为转录因子行使功能。为明确LcSMXL7 蛋白的亚细胞定位，将LcSMXL7 构建入pCAMBIA2300-GFP 载体，并转化本氏烟草。结果如图5 所示，在细胞核位置能够看到强烈的荧光信号，表明LcSMXL7-GFP 融合蛋白定位于细胞核。

3 讨论

荔枝作为岭南地区极具特色的水果，深受市场欢迎。但生产中荔枝存在“爱花不惜子”的现象，即荔枝花量大，但坐果少。荔枝花序呈聚伞花序圆锥状排列，花序长度为10～40 cm，小花数量一般在200～1500 朵，大花穗的小花数量可达4000 朵以上[17]。小花数量过多会消耗树体大量营养，影响荔枝坐果。荔枝的小花附着于分枝之上，而荔枝有1～4 级分枝，这暗示可通过调控花穗分枝数量改善荔枝坐果。植物分枝重要调控基因SMXL7 可有效的调控分枝， 最近的研究发现SMXL7 通过招募共抑制子TPL/TPR，直接结合下游转录因子BES1、SPL9 及SPL15 启动子并抑制這些转录因子对BRC1 基因的转录，进而促进植物分枝[13]。

本研究首次报道了1 个荔枝独脚金内酯的早期响应基因LcSMXL7 ， 该基因编码区全长3408 bp，编码1135 个氨基酸，比拟南芥的SMXL7基因略大。保守结构域分析发现LcSMXL7 蛋白含有2 个Clp 结构域和1 个AAA_2 结构域，结构域的种类和数量与拟南芥SMXL7 蛋白一致，这表明LcSMXL7 是一个蛋白结构保守的SMXL7成员，暗示其具有SMXL7 相似的蛋白功能。拟南芥中SMXL7 主要在腋芽和侧枝中表达，调控腋芽萌发和侧枝发育[18]。在荔枝中LcSMXL7 组成型表达，在茎、种子、花穗、叶片、雄花和果皮中均有一定的表达量，暗示LcSMXL7 在多个器官和组织中调控荔枝的生长发育。亚细胞定位分析结果显示该基因编码蛋白定位于细胞核，暗示该蛋白与SMXL7 一样，可作为转录调控因子行使功能[13]。转基因结果显示过表达LcSMXL7 的拟南芥转基因株系分枝数量显著提高，说明该基因可促进植物的分枝发育，是分枝发育的正调控因子，也证明该基因功能保守，与拟南芥SMXL7 功能类似。鉴于LcSMXL7 在花穗中有一定的表达量，且能够促进拟南芥分枝生长发育，推测该基因在荔枝花穗分枝发育过程中起到重要作用。

综上所述，本研究从荔枝中克隆到1 个荔枝独脚金内酯的早期响应基因LcSMXL7，对其蛋白的基本理化性质、表达模式、进化关系和基因功能进行分析。结果表明，LcSMXL7 在茎和种子中高表达，其编码蛋白拥Clp 和AAA_2 结构域，是一个典型的D53/SMXLs 家族成员。该蛋白定位于细胞核，是一个分枝形成的正调控因子。本研究结果为进一步揭示荔枝花穗分枝发育提供了重要线索，关于其在荔枝花穗发育中的功能还有待进一步研究。