邱 靖,李嘉宝,朱大海,陈 昕

(1.南京林业大学,南方现代林业协同创新中心,南京林业大学生物与环境学院,江苏 南京 210037;2.三江学院,江苏 南京 210012;3.龙溪-虹口国家级自然保护区,四川 成都 611830)

花楸属(Sorbus)隶属于蔷薇科苹果亚科,主要分布于北半球的温带地区,我国是该属的物种多样性分布中心[1]。该属通常分为6个亚属:复叶的花楸亚属(subg.Sorbus)和subg.Cormus;单叶的白花楸亚属(Subg.Aria)、水榆亚属(Subg.Micromeles)、Subg.Chamaemespilus和subg.Torminalis[2],或将水榆和Chamaemespilus亚属并入白花楸亚属而分为4个亚属[3]。分子系统学研究多认为花楸属为复系,支持将亚属提升到属的地位[4-6],但也有研究表明亚属间界限不清晰,各自不能形成单系[7]。

不仅花楸属的界定和属下分类存在分歧,物种数量和种间亲缘关系认知也存在显著不同[3,8-9]。直脉组(SorbusSect.Alnifoliae)即是很好例证。直脉组是Aldasoro等[3]最新单叶花楸属植物分类修订中白花楸亚属的7个组之一,包括水榆花楸[S.alnifolia(Sieb. et Zucc.)K. Koch]、石灰花楸[S.folgneri(C.K. Schneid.) Rehder]、日本花楸[S.japonica(Decne)Hedl]、神农架花楸(S.yuanaSpongberg)和长果花楸(S.zahlbruckneriC.K. Schneid.)5种。直脉组的界定同俞德浚等[10]的直脉系(Ser.AlnifoliaeT.T. Yu)差异很大。直脉系4种植物中仅水榆花楸1种被置于直脉组,且水榆花楸的两个变种棱果花楸(S.alnifoliavar.angulataS. B. Liang)和裂叶水榆花楸(S.alnifoliavar.lobulataRehd.)均被作为日本花楸的异名处理。

基因组大小是指染色体基数x的DNA含量Cx值,或体细胞的DNA含量2C值。被子植物的基因组大小相差约2 400倍[11]。基因组大小差异不仅存在于不同物种之间,还存在于同一物种不同倍性的个体之间。同种植物的2C值有随染色体倍性增加而成倍增加的趋势[12],同属植物的2C值亦有随倍性加大而增加的趋势[13]。因而,2C值作为物种的重要特征,不仅可为物种的分类界定和亲缘关系理解提供依据,2C值与染色体计数相结合,还可准确判断植物倍性。花楸属植物倍性复杂,基因组大小测定是该属植物倍性判断和系统演化理解的重要方法[14-17]。

叶表皮形态特征是植物本身遗传特性表达,具有分类学研究价值[18-19]。叶表皮细胞大小同基因组大小之间还存在着一定的相关性。同一物种多倍体个体的细胞显著大于它们的二倍体祖先[20],不同物种的基因组大小同表皮细胞和气孔大小也呈现正相关[21]。叶表皮特征尤其是气孔特征还同物种生态环境适应策略密切关联[22]。因而,细胞大小、基因组大小、倍性特征及其相关性具有分类、生态适应和生活史对策上的研究价值[23]。

本研究采用流式细胞术对直脉组植物的基因组大小进行测定并推断其倍性,利用光学和电子显微镜对叶表皮细胞和气孔的定性和定量性状进行分析,以期探讨基因组大小和叶表皮特征的分类学意义以及基因组大小同倍性和细胞大小之间的相关性,同时为棱果花楸和裂叶水榆花楸的分类处理提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

以花楸属直脉组5种花楸:水榆花楸、石灰花楸、日本花楸、神农架花楸和长果花楸,以及具有分类争议的2个变种裂叶水榆花楸和棱果花楸为研究对象。每居群选择3个单株,单株间距50 m以上。采集上述花楸野生居群中成年单株的健康叶片,硅胶干燥,-80 ℃低温保存备用;采集完整叶片压干;凭证标本保存于南京林业大学标本馆(NF),标本采集信息见表1。

表1 花楸属直脉组植物采集信息

1.2 实验方法

1.2.1 基因组大小测定

以水稻品种日本晴(Oryzasativasubsp.japonica‘Nipponbare’; 2C=0.91 pg)为内标,取待测样品1 cm2与等量内标共同置于1 mL预冷的WPB解离液[24]中,用锋利的刀片快速切碎。用38 μm (400 目)的滤网过滤,获得细胞核悬浮液。随后向其中加入 50 μL 预冷的 PI 染液,置于 4 ℃冰箱避光染色 10 min。采用 BD Influx 流式细胞仪进行样品检测,低速收集 5 000～10 000 个颗粒。选用 488 nm 蓝光激发 PI,于 FL2 通道收集 PI 发射的荧光强度;每个样本做 3 次平行测定。

使用BD Influx自带软件FACSTMSortware1.0.0.650对图像及检测结果进行处理。样本基因组大小的计算公式为:待测样本基因组大小为待测样本G0或G1峰荧光均值与对照样本G0或G1峰荧光均值之比与对照样本基因组大小之积。其中,G0为分裂停止期,G1为细胞DNA复制未开始期。变异系数(coefficient of variation, CV)控制在5%以内。

1.2.2 叶表皮微形态特征观察测量

光学显微镜观察。从每种/变种花楸中随机选取成熟叶片2片,在尽量避开中脉及较大侧脉的每一叶片中部切取面积5 mm × 5 mm的小块2块,加入沸水中煮40 min将其软化。随后将叶片转移至冰醋酸与30%(体积分数)过氧化氢的等比混合液中,于60 ℃下水浴加热14～16 h至叶片全白且有透明气泡出现,便可将叶片取出,用镊子轻轻分离上下表皮并除去残留叶肉。将分离好的上下表皮置于1%(质量分数)番红-50%(体积分数)酒精溶液中染色20 min,取出表皮放入蒸馏水中漂洗约20 min。最后用中性树胶封片,于室内自然晾干。在Nikon Eclipse Ci-S(日本)光学显微镜的40倍物镜下随机选取每种植物的5个上表皮视野和10个下表皮视野进行观察和拍照。从视野中随机选取上、下表皮细胞及气孔器各50个,用ImageJ 1.4.8软件测量表皮细胞面积、气孔器长、宽及气孔面积。统计单位视野内气孔数和表皮细胞数,计算气孔密度(DS)和气孔指数(IS)。计算公式如下:DS=S/N,IS=[S/E+S)]× 100%。式中:N为单位视野面积,S为单位视野面积上的气孔数,E为相同面积内的表皮细胞数。

扫描电镜观察。先用毛笔轻轻拂去叶片表面灰尘,每种叶片切取 5 mm × 5 mm 的小块,在 FEI-Quanta 200 扫描电子显微镜(美国)下对上、下表皮进行拍照、观察及记录。

气孔器所用术语参考Dilcher[25]、王宇飞等[26];叶片角质膜及蜡质纹饰所用的术语参考Barthlott等[27]。

1.2.3 数据分析

所有数据用Excel进行统计处理,结果以“平均值±标准误差”表示,利用SPSS 22.0对数据进行ANOVA方差分析。

2 结果与分析

2.1 基因组大小

由花楸属直脉组7种/变种基因组流式直方图见图1。

P1.水稻‘日本晴’(Oryza sativa subsp. japonica‘Nipponbare’);P2.样品材料sample。

由图1可见,内标峰和样品峰区分度良好,显示了水稻日本晴作为内标测定的数据可靠性。花楸属直脉组植物2C值和Cx值分别介于1.348～1.586 pg和 0.674～0.793 pg(表2),长果花楸2C值最大且显著高于其他类群,神农架花楸值最小且显著低于其他类群。水榆花楸及其变种棱果花楸和裂叶水榆花楸2C值和1C值差异不显著,三者显著高于日本花楸。

表2 花楸属直脉组植物的基因组大小及倍性水平

依据C值库(https: //cvalues. science. kew. org/)中花楸属植物不同倍性的2C值变化区间,推断直脉组植物均为二倍体。

2.2 叶表皮微形态特征

2.2.1 叶表皮细胞微形态特征

直脉组花楸的叶表皮细胞兼具多边形和不规则形或仅具不规则形。垂周壁隆起或凹陷,多边形细胞的垂周壁有平直和弧形两种样式,不规则形细胞的垂周壁呈波状。裂叶水榆花楸(图2C)和长果花楸(图2G)的上、下表皮均为不规则形,其他5个分类群则兼具多边和不规则形。

1.上表皮adaxial epidermis; 2.下表皮abaxial epidermis。A.水榆花楸S. alnifolia;B.棱果花楸S. alnifolia var. angulata;C.裂叶水榆花楸S. alnifolia var. lobulata;D.石灰花楸S. folgneri;E.日本花楸S. japonica;F.神农架花楸S. yuana;G.长果花楸S. zahlbruckneri。下同。The same below.

垂周壁凹陷平周壁隆起的仅见于棱果花楸上下表皮(图3B)和石灰花楸上表皮(图3D),其他分类群均为垂周壁隆起,平周壁凹陷。

a、b.上表皮 adaxial epidermis (a. 800×;b. 3 000×);c、d、e.下表皮 abaxial epidermis (c. 200×,d. 800×;e. 3 000×)。

细胞表面纹饰有局部加厚、脊状隆起、皱褶、网纹、光滑5种类型,局部加厚最为常见。叶表皮微形态部特征见表3。结合电镜下叶表皮特征(图3)可知,棱果花楸近光滑的上表皮(图3B)、石灰花楸脊状隆起的上表皮(图3D)、日本花楸网纹状的上表皮(图3E)使三者易于同其他类群区分开来。表皮蜡质纹饰平滑层、壳状、颗粒状、片状、线状5种类型,平滑层见于水榆花楸(图3A)和长果花楸(图3G),其他分类群为壳状;颗粒状为共有纹饰(图3);片状、线状则同时出现在水榆花楸(图3A)、裂叶水榆花楸(图3C)和长果花楸(图3G)中,棱果花楸的下表皮(图3B)和石灰花楸的上表皮(图3D)具线状纹饰。

表3 花楸属直脉组植物叶表皮微形态特征(定性性状)

分类群间的表皮细胞面积差异显著。上表皮细胞面积介于605.05～967.63 μm2,下表皮细胞面积介于496.84～826.62 μm2(表4)。长果花楸的上、下表皮面积均最大且显著大于其他分类群,神农架花楸的上表皮面积最小,下表皮面积大于石灰花楸但显著小于另5个分类群。裂叶水榆花楸和日本花楸的上下表皮细胞均显著大于水榆花楸和棱果花楸。

表4 花楸属直脉组植物叶表皮细胞与气孔数量微形态特征(定量性状)

2.2.2 气孔器微形态特征

花楸属直脉组植物的气孔器均分布在叶片下表皮脉间区,气孔器都由两个肾形保卫细胞组合而成,无副卫细胞,气孔类型均为无规则型(图2)。

气孔器多呈椭圆形或圆形,气孔器长度介于24.41～30.81 μm,分类群间无显著差异。气孔器宽度和面积分别介于19.58～22.87 μm和457.59～564.55 μm2,两者在分类群间存在显著差异(表4)。裂叶水榆花楸的气孔器长、宽、面积3项指标均为最低,长果花楸气孔最长,棱果花楸气孔最宽且面积最大。

保卫细胞凸起或平,不凹陷。除裂叶水榆花楸(图3C)而外,其他6个分类群均具有完全或不完全的环形外缘,其中水榆花楸(图3A)、棱果花楸(图3B)和石灰花楸(图3D)气孔两极T状加厚。气孔纹饰有壳状、颗粒状、片状或近光滑。

气孔密度介于101.82～265.02 个/mm2,日本花楸最低,棱果花楸密度最大,后者是前者的2.01倍。气孔指数为7.64%～17.08%,棱果花楸最高,日本花楸最低。

2.2.3 表皮毛

直脉组植物成熟叶片的表皮具毛或光滑。具毛的植物有石灰花楸(图3D)、日本花楸(图3E)、神农架花楸(图3F)和长果花楸(图3G)4种,且毛状体均位于下表皮且呈带状。石灰花楸的毛被最密,覆被下表皮致使细胞形状和纹饰均不可见。水榆花楸及其变种棱果花楸、裂叶水榆花楸叶表皮光滑(表3)。

2.3 相关性分析

基因组大小与叶表皮性状之间、表皮性状各特征之间的相关性分析结果如表5。由表5可见,基因组大小与上、下表皮细胞面积以及气孔器长、宽、面积均呈正相关,而同气孔密度和气孔指数呈负相关。基因组大小与上表皮细胞面积呈显著正相关(R=0.737,P<0.05),与气孔器长度相关性位列第2(R=0.562)。表皮性状各特征之间相关性最大的为气孔密度和气孔指数,其次为气孔长宽和气孔面积,均呈极显著相关(P<0.01);上下表皮细胞面积之间呈显著正相关,而上下表皮细胞面积与气孔密度之间也均呈显著负相关(P<0.05)。

表5 花楸属直脉组植物的基因组大小与叶表皮性状的相关系数

3 讨 论

花楸属直脉组植物Cx值为0.674～0.793 pg,同蔷薇科其他属一样[28],均属于极小基因组(Cx≤1.4 pg)。基于流式细胞术(FCM)倍性推断的可靠性因类群而异,如同属苹果亚科(Maloideae),2C值在唐棣属(Amelanchier)的不同倍性之间分化良好[29],在山楂属(Crataegus)不同倍性之间则存在重叠区域[30]。花楸属植物不同倍性的2C值区分良好,不存在重叠区域,基于FCM基因组大小测定的倍性推断可靠性高[16-17]。本实验直脉组植物均为二倍体,2C值的最高值在前期报道范围内,而最低值为1.348,较前期报道略低;水榆花楸而外的6个分类群基因组大小为首次报道[27]。原产欧洲的白花楸亚属植物有2x、3x、4x、5x4种倍性水平,多倍体和无融合生殖类群数量众多[31],该亚属在亚洲尚无多倍体报道,亚洲是否存在多倍体还需进一步的实验研究。

叶表皮特征在蔷薇科具有重要的分类价值[32-33]。直脉组植物叶表皮具有一定的共同特征,如均具有等径或伸长的细胞、气孔均分布于下表皮且均为无规则形等,但其表皮纹饰、蜡质类型、气孔特征等同苹果亚科的苹果属(Malus)[34]、山楂属[13]、乃至花楸属复叶组[35]差异较大。直脉组的叶表皮综合特征可以为组内物种鉴定提供有价值的依据,通过细胞形状可以将该组分为两类,仅具有不规则形细胞的裂叶水榆花楸和长果花楸,两种可以通过气孔是否具有环形外缘进一步区分开来,兼具多边形和不规则形的5个分类群可以通过毛被有无及疏密、垂周壁凹陷或隆起、表皮纹饰等进行区分。争议分类群裂叶水榆花楸的上、下表皮均为不规则形、棱果花楸的垂周壁凹陷平周壁隆起,加之两者的表皮细胞和气孔的大小和纹饰,可以将两者同水榆花楸和日本花楸明确区分;日本花楸网纹状纹饰使之显著区别于其他6个分类群。因而本研究不支持Aldasoro等[3]将棱果花楸和裂叶水榆花楸作为日本花楸异名的分类处理。

基因组大小和细胞大小的相关性在植物界普遍存在,本研究也为这种相关性提供了佐证。基因组大小对细胞大小,尤其是气孔大小和密度的影响,进而可能影响植物的生理活动,在生态适应和生活史对策上起做重要的作用[21];与此同时,气孔也会在一定程度上通过响应环境变化而推动基因组大小进化[22]。本研究中各个种的采集地和海拔有很大差异,其基因组大小与细胞特征是否会随环境变化而呈现不同的适应响应还需要更多居群的研究证据。