徐 慧,姚霞珍,佟珂珂,邢 震,李 垚

(西藏农牧学院资源与环境学院,西藏 林芝 860000)

牡丹(Paeonia×suffruticosa)属芍药科芍药属,是我国传统名贵花卉,花大色艳、雍容华贵,素有“国色天香”“花中之王”的美称,具有极高的观赏价值。牡丹鲜花花香浓郁,花香是其观赏性状之一,有研究表明牡丹的挥发性成分主要包括萜烯类、醇类、苯环/苯丙素类和烷烃类,其组成和含量在不同品种和不同花发育阶段差异明显,从而导致不同牡丹品种花香的差异[1]。目前牡丹的育种目标大多集中于花色和花型,花香性状的定向选育未得到重视,牡丹花香的研究主要集中在不同品种牡丹上,而对野生牡丹香气成分的研究较少[2-3]。Zhang等[4]分析了紫斑牡丹(Paeoniarockii)、紫牡丹(P.delavayi)、黄牡丹(P.lutea)花瓣精油中的化学成分,研究表明黄牡丹和紫牡丹精油中含有较多的萜类化合物,主要包括氧化芳樟醇、异植醇、法尼醇和植醇,同时含有较显著的芳香成分,释放出药草清香。另有研究表明,紫斑牡丹挥发性成分的主要组分是6,9-十七烷二烯,呈现出浓郁的脂粉香,在对部分紫斑牡丹品种花瓣挥发性成分测定后发现,多数样品的花瓣挥发性主成分与野生紫斑牡丹一致,原因主要为栽培紫斑牡丹遗传背景较为单一,因此稳定遗传了野生紫斑牡丹花香的特征[5]。Luo等[6]在9种野生牡丹中共检测出124种化合物,通过主成分分析和聚类分析将9种牡丹划分为两个集群,四川牡丹(P.decomposita)、卵叶牡丹(P.qiui)、紫斑牡丹(P.rockii)、矮牡丹(P.jishanensis)和杨山牡丹(P.ostii)为一个集群,黄牡丹(P.lutea)、紫牡丹(P.delavayi)、大花黄牡丹(P.ludlowii)、狭叶牡丹(P.potanini)为另一集群,两个集群在地理分布上与野生牡丹分布相一致,通过对香气成分的研究进一步揭示了野生牡丹种间的亲缘关系。

大花黄牡丹是西藏特有丛生落叶花灌木,花大色艳、植株高大,具有极高的观赏和药用价值,目前处于濒危状态,已被列为国家二级保护植物[7-8];黄牡丹为我国西南特有野生牡丹[9],我国牡丹育种者从20世纪末开始利用黄牡丹作为重要的育种亲本开展远缘杂交育种工作,并培育出了多个优良杂交后代[10];杨山牡丹是江南牡丹品种群的主要起源种,参与了中原牡丹、西南牡丹品种群的形成[11-13]。3种野生牡丹均是我国重要的花卉种质资源,感官上香气各异,大花黄牡丹的香气较为清新温和,黄牡丹呈现出浓郁甜香,杨山牡丹的香气较为清幽淡雅。本研究采用顶空-气相色谱质谱联用(HS-GC-MS)技术对上述3种牡丹花器官不同部位的挥发性成分进行分析与鉴定,以明确3种牡丹花器官挥发性成分释放的关键部位并得出各部位在挥发性成分组成和含量上的差异,对香气独特的牡丹种质资源进行评价和筛选,以期为牡丹花香育种、资源开发利用等后续研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试材

试验材料为具有特殊香气的3种野生牡丹,即多年生大花黄牡丹(西藏特有野生种)、黄牡丹(引种自西藏林芝镇)、杨山牡丹(引种自四川成都市)花器官的不同部位,包括整花、花瓣、雄蕊,3种牡丹均于2021年5月初采自西藏自治区林芝市。主要仪器为气相色谱-质谱联用仪(日本岛津,GC-MS QC2030),装有NIST 17谱库检索系统,色谱柱型号为SH-Rxi-5Sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.2 挥发性成分提取

3种牡丹花期相近,选择晴天11:00左右采集盛开期且长势良好的3种牡丹花各3朵,密封保存迅速带回实验室。随机称取花瓣、雄蕊样品2.6 g,大花黄牡丹、黄牡丹和杨山牡丹整花样品进行去除花萼、花柄等无香部位的处理,样品质量分别为4.5、3.5和4.8 g。将花瓣与雄蕊样品置于20 mL、整花样品置于100 mL的顶空进样瓶中,密封后放入自动顶空进样仪中,进样体积设置为2 000 μL,60 ℃下预热并平衡30 min后取样进行GC-MS分析。

1.3 GC-MS条件

GC条件:进样口温度230 ℃,进样模式为不分流进样,进样时间3 min;载气为He(99.999%),柱流量0.8 mL/min;色谱柱梯度升温,起始温度25 ℃,保留6 min,以3 ℃/min的速率升温至40 ℃并保留4 min,再以8 ℃/min的速率升温至180 ℃并保留2 min,最后以15 ℃/min的速率升温至230 ℃并保留7 min。色相总分析时间为44.83 min。

MS条件:电离方式为EI;离子源温度200 ℃,接口温度230 ℃;溶剂延迟时间4 min;扫描模式为全模式扫描,扫描质量范围45～500 amu。

1.4 数据分析

使用GC自带的实时分析软件处理实验数据,将所得各样品的谱图与NIST 17谱库中标准物质的谱图进行比对,并结合相关文献进行人工解谱,仅报道相似度大于90%的物质。基于面积归一化法,利用各个物质的峰面积占总峰面积的百分比来表示该物质的相对含量。使用Excel 2013软件对挥发性成分的数量和相对含量进行统计分析,使用SIMCA 14.1进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)。采用R软件及Origin 9.1绘图。

2 结果与分析

2.1 3种牡丹花器官各部位挥发性成分分类

从3种牡丹花器官各部位挥发性成分种类及其相对含量(表1)可知,大花黄牡丹、黄牡丹、杨山牡丹整花中各检出挥发性物质9、6、9类,花瓣中各检出挥发性物质8、8、6类,雄蕊中各检出挥发性物质8、10、9类。3种牡丹雄蕊中的烷烃类化合物均远高于整花与花瓣,杨山牡丹雄蕊中烷烃类化合物相对含量为41.58%,种类多达15种,其中检测出的十四烷、十五烷、3-甲基十五烷、十六烷、十七烷均为牡丹花香中主要的脂肪酸衍生物。烯烃类化合物大量存在于3种牡丹的各部位,尤其是黄牡丹整花中的烯烃类化合物相对含量高达80.37%,花瓣中高达69.32%,在黄牡丹花瓣中检出相对含量较高的挥发性物质为α-蒎烯(34.23%)、β-古巴烯(25.39%)、芳樟醇(13.15%)、反式-氧化芳樟醇(呋喃型)(9.82%)、苯乙酮(4.47%)。

表1 3种牡丹花器官各部位挥发性成分种类及其相对含量

芳香族类化合物1,3,5-三甲氧基苯存在于杨山牡丹花器官各部位中。醇类化合物主要存在于大花黄牡丹和黄牡丹花器官中,杨山牡丹相较于其他两种牡丹而言,花器官中的醇类化合物相对含量较低。酮类化合物大量存在于大花黄牡丹花器官中,大花黄牡丹雄蕊中的酮类化合物相对含量高达32.33%。酯类化合物相对含量最高的部位为大花黄牡丹的雄蕊,共检出7种酯类化合物,相对含量为12.25%,酯类多具有花香、水果香气,由醇类和酸类通过酯化反应生成[3]。酸类化合物共检出6种,仅在大花黄牡丹整花、黄牡丹花瓣、黄牡丹雄蕊、杨山牡丹整花中被检出,且相对含量均低于1%。甾类化合物共检测出5种,相对含量最高的为大花黄牡丹的花瓣(表1)。

2.2 3种牡丹花器官挥发性成分分析

从大花黄牡丹、黄牡丹、杨山牡丹的不同部位中共检测出挥发性成分147种,包括烷烃类化合物28种,酯类化合物28种,烯烃类化合物23种,醇类、醛类、酮类化合物各12种,酸类、芳香族类化合物各6种,甾类化合物5种,其他类化合物15种,总相对含量从96.92%到100%。3种牡丹花朵不同部位香气中检测到的挥发性成分与数量存在较大差异,化合物名称、保留时间及各成分的相对含量见附表1(参见http://nldxb.njfu.edu.cn)。

3种牡丹花器官不同部位挥发性成分分析 附表1

2.2.1 大花黄牡丹(P.ludlowii)

大花黄牡丹花器官香气成分在3种牡丹中最为复杂,共检出挥发性物质69种,其中整花含有39种,花瓣含有27种,雄蕊含有29种。整花中的挥发性物质主要为醛类、酮类和烯烃类化合物,相对含量均大于22%。其中相对含量较高的醛类物质主要包括6,6-二甲基双环[3.1.1]庚烷-2-甲醛、壬醛、辛醛、庚醛;酮类物质以苯乙酮、茉莉酮、7-亚乙基-双环[3.3.0]辛-3-酮为主;烯烃类化合物主要为α-蒎烯、β-古巴烯、β-月桂烯、D-柠檬烯。花瓣中以醇类化合物相对含量最高,达到28.14%,酮类和烯烃类化合物相对含量也均高于21%,3类化合物中相对含量较高的物质是β-古巴烯、苯乙酮、芳樟醇,相对含量分别为20.21%、19.55%、13.65%。雄蕊中挥发性物质以酮类、醇类和烷烃类化合物为主,其中苯乙酮和芳樟醇的相对含量均大于16%,辛烷和大根香叶烯D的相对含量也较高,分别达到9.38%和7.55%,而在整花中大量存在的6,6-二甲基双环[3.1.1]庚烷-2-甲醛,雄蕊中未检出,其在花瓣中相对含量也较低,提示该物质可能大量存在于整花中的其他部位,如雌蕊部位。在大花黄牡丹花器官3部位中均大量存在的物质是苯乙酮和芳樟醇。大花黄牡丹3个部位中的共有成分为9种(图1A),重合率仅为13%,说明3个部位成分差异较大,只在整花中检测到的成分有22种,花瓣中独有的成分为13种,雄蕊的独有成分主要有17种,整花与花瓣、雄蕊中成分重合率均较低且相近,说明大花黄牡丹花瓣和雄蕊部位均为花朵香气做出一定贡献。

图1 3种牡丹花器官挥发性成分维恩图Fig.1 The Venn diagram of volatile components

2.2.2 黄牡丹(P.lutea)

黄牡丹花器官中共检出挥发性物质53种,在整花、花瓣、雄蕊中各检出30、28、38种物质,有别于其他两种牡丹的是,黄牡丹雄蕊中检出的物质种类最多。黄牡丹整花中检测出烯烃类化合物的相对含量高达80.37%,其中α-蒎烯的相对含量为67.33%。花瓣中的挥发性物质以烯烃类和醇类化合物为主,相对含量分别为69.32%、23.43%,其中α-蒎烯、β-古巴烯和芳樟醇的相对含量分别为34.23%、25.39%、13.15%。黄牡丹雄蕊中相对含量最高的也为烯烃类化合物,其中α-蒎烯、β-古巴烯的相对含量均高于15%,且雄蕊中烷烃及酯类化合物相对含量远高于其他两个部位,其中辛烷的相对含量高达26.69%,5种酯类化合物的相对含量为2.59%,同时检测出了在其他2部位不存在的甾类化合物1种和其他类化合物3种。黄牡丹花器官3个部位中均含有的成分有15种(图1B),重合率为28.3%,花瓣与整花部位共有物质占整花物质的76.7%,说明黄牡丹花瓣与整花的共有成分构成了黄牡丹的基本香气轮廓,共有成分中相对含量较高的α-蒎烯、β-古巴烯和芳樟醇主导了黄牡丹的特征香型。

2.2.3 杨山牡丹(P.ostii)

杨山牡丹花器官中共检出61种挥发性物质,其中整花40种,雄蕊35种,花瓣28种,花瓣中检出的化合物种类最少。杨山牡丹整花中烯烃类化合物相对含量为73.17%,其中α-蒎烯、罗勒烯相对含量分别为50.19%、19.05%,α-蒎烯仅在整花中被检出,花瓣和雄蕊中未检出,同时酸类化合物仅在整花中检测出2种,花瓣和雄蕊中未检出。花瓣中检出的烯烃类物质相对含量高达88%,其中罗勒烯的相对含量为81.58%,并且在杨山牡丹3部位的总离子流图中,花瓣中的罗勒烯丰度值远高于其他挥发性物质,提示杨山牡丹花瓣的主要赋香物质为罗勒烯。杨山牡丹雄蕊中检出的烷烃类化合物相对含量最高,为41.58%,烯烃类化合物次之,相对含量为35.82%,其中罗勒烯、十五烷、十三烷、辛烷、十七烷相对含量较高。杨山牡丹花器官3个部位共有的挥发性成分有16种(图1C),主要为烯烃类、烷烃类、醛类和酯类化合物,重复率为26.2%,共有的物质主要有罗勒烯、十五烷、十七烷、(E)-14-十六烯醛、(Z)乙酸-5-十二烯醇酯。整花与花瓣、雄蕊中检出的共有物质占整花物质的47.5%、55.0%,整花中独有物质为15种,花瓣中独有的物质为8种,雄蕊中独有物质为12种。

2.3 挥发性成分PCA和PLS-DA分析

为进一步分析3种牡丹花器官中挥发性成分的差异,采用PCA对3种牡丹各样品中挥发性成分的相对含量进行分析[14]。其中主成分1、主成分2和主成分3的方差贡献率分别为37.7%、20.8%和15.9%,所有样品点均在95%置信区间内。3种牡丹各样品分布在不同的区间且呈现出良好的聚类,大花黄牡丹雄蕊、花瓣、整花与主成分1呈正相关,杨山牡丹雄蕊、花瓣、整花与主成分1呈负相关,黄牡丹花瓣、雄蕊、整花与主成分2呈正相关;3种牡丹在PC3方向上存在重叠,区分不显著(图2A、2B)。3种牡丹花器官各部位中的挥发性成分存在一定差异,大花黄牡丹和黄牡丹花器官中的挥发性物质差异相对较小,可能与3种牡丹归属于不同牡丹亚组有关,大花黄牡丹和黄牡丹属于肉质花盘亚组,而杨山牡丹属于革质花盘亚组。

图D中挥发性成分序号同附表1。No. in Fig D. are the same as those in schedule 1 (http://nldxb.njfu.edu.cn).

从PCA相应的载荷图(图2C)可以看出,芳樟醇、苯乙酮、苯甲酸甲酯、乙醇、茉莉酮、十甲基环五硅氧烷、八甲基环四硅氧烷、β-古巴烯等与主成分1有较大的正相关,十七烷、反式-β-罗勒烯、Myroxide、2-甲基十六烷、(Z)乙酸-5-十二烯醇酯、(E)-14-十六烯醛、十五烷等与主成分1有较大的负相关,(+)-双环大根香叶烯、Z,Z,Z-1,5,9,9-四甲基-1,4,7-环十一碳三烯、萘、反式-氧化芳樟醇(呋喃型)、石竹烯、古巴烯、α-蒎烯与主成分2有较大的正相关。结合图2B可知,以苯乙酮、茉莉酮、α-蒎烯、(+)-双环大根香叶烯、Z,Z,Z-1,5,9,9-四甲基-1,4,7-环十一碳三烯、石竹烯、古巴烯、α-蒎烯、β-古巴烯为主的酮类和烯烃类化合物是导致大花黄牡丹和黄牡丹香气差异较大的物质,以十七烷、十五烷、十三烷、十四烷、反式-β-罗勒烯、Myroxide、罗勒烯为主的烷烃类和烯烃类化合物是导致杨山牡丹香气有别于其他2种牡丹的主要物质。

在利用PCA观察到3种牡丹样本间的分类趋势后,为进一步了解引起样本间差异的变量,采用了PLS-DA对影响分组趋势的标志性差异成分进行了判别分析。变量投影重要性(variable importance in the projection,VIP,式中记为VVIP)是PLS-DA模型对不同化合物的量化评分,VIP值越大,表明相对应的变量对3种牡丹分类的贡献率越大。由PLS-DA模型VIP得分图(图2D)可知,共有15种挥发性物质可作为区分3种牡丹的差异性成分(VVIP>1,P<0.05),包括苯乙酮、芳樟醇、反式-氧化芳樟醇(呋喃型)、α-蒎烯、β-古巴烯、罗勒烯、反式-β-罗勒烯、十五烷等,差异性成分在3种牡丹花器官中的相对含量差异较大,这些物质在不同种牡丹中的含量差异对相应牡丹香气特征的形成具有重要意义。

3 讨 论

植物花香是由花器官释放出来的挥发性混合气体物质[15],挥发性物质种类的差异性可导致植物花香的不同。大多数植物的花瓣是花香的主要释放部位,其他器官也能散发少量香气,如雌蕊、雄蕊、蜜腺[16]。在毛茛属植物Rannunculusacris中,花瓣和雄蕊对整朵花的花香具有同样重要的贡献[17];山茶‘克墨瑞大牡丹’(Camellia‘Kramer’s supreme’)相同质量的雄蕊香气挥发量是花瓣的1.5倍[18]。本研究发现3种牡丹雄蕊中检测出的挥发性物质种类均多于花瓣,同时3种牡丹雄蕊中烷烃类化合物的相对含量均远高于整花与花瓣,推测雄蕊可能是烷烃类化合物的重要合成部位。基于检出的147种挥发性成分相对含量构建的PCA可实现将大花黄牡丹、黄牡丹、杨山牡丹不同部位的样品准确分类,对挥发性成分进行研究可为后续牡丹组植物的亲缘关系及系统发育研究提供一定参考,通过PLS-DA模型筛选出的15种差异性成分在3种牡丹花器官中的相对含量存在差异,这些成分对不同种牡丹香气特征的形成具有重要作用。

研究表明,苯乙酮是茶花(Camelliasinensis)的特征香味化合物[19],同时也是日化香精、定香剂、食用香精等的主要组分[20]。芳樟醇属于链状萜烯醇类,是典型的花香韵物质[21],广泛存在于植物精油中,具有抗炎、抗菌、镇静和保护神经等作用[22],是食品、药品、日化香精行业的重要原料[23]。苯乙酮和芳樟醇给大花黄牡丹带来较为浓烈的花香气息。苯乙酮对大黄蜂有明显的趋避现象,大黄蜂不会为挥发性有机化合物(VOC,volatile organic compounds)中含有苯乙酮的Antirrhinummajusssp.pseudomajus授粉[24];在3个邻近的毛地黄(Digitalispurpurea)、吊钟柳(Penstemondigitalis)种群中,传粉者对花香的选择呈现出显著的种群间差异,挥发性成分中的芳樟醇是影响传粉者行为的重要原因[25]。传粉者对VOC的特异性选择可驱动植物香味的释放模式与组分发生改变,因此部分VOC可作为吸引特定传粉者的潜在工具[19]。大花黄牡丹的主要香气化合物为苯乙酮和芳樟醇,在其3部位中均检测出较高相对含量的苯乙酮和芳樟醇,未来可基于这两种成分针对性地开发利用大花黄牡丹资源。

黄牡丹的主要香气化合物为α-蒎烯、β-古巴烯和芳樟醇,在黄牡丹3部位均大量存在的α-蒎烯属草香韵,具有类似于松木、松脂的香气[21],α-蒎烯被大量用于合成松油醇、里那醇等香料[26-27],同时具有提神醒脑和活血等作用[28]。研究发现黄牡丹花瓣精油具有较强的抗氧化力,对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2-联氢-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)的清除能力强[4],因此黄牡丹具有巨大的开发价值,可作为天然抗氧化剂和香精香料应用于制药和日化产业。

杨山牡丹的主要香气化合物为罗勒烯、α-蒎烯、十五烷。罗勒烯具有花香、草香并伴有橙花油气息[29],属于无环单萜类化合物,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用[30],同时具有多种生物学功能,包括吸引授粉昆虫与诱导植物抗性,有研究表明植物在经过罗勒烯的处理后,可以启动广谱性防御应答反应,从而增强抵抗外界刺激的能力[31-33]。罗勒烯在杨山牡丹花瓣中的相对含量高达81.58%,推测杨山牡丹的主要赋香部位在花瓣,花瓣部位极具开发与利用价值。

由于栽培环境和实验方法等方面的不同,本研究检测出的3种牡丹花挥发性成分与前人的研究有一定差别。将本试验的研究结果与Luo等[6]的研究进行对比,均发现大花黄牡丹和黄牡丹花瓣中含有较高含量的芳樟醇,嗅觉阈值低的芳樟醇赋予大花黄牡丹和黄牡丹花朵较为强烈的花香属性;在杨山牡丹花中均检测出相对含量较高的十五烷(蜡味[6]),结合检出的其他挥发性成分共同赋予了杨山牡丹草香和蜡质香味属性。明确不同种类牡丹的挥发性成分,可为后续挖掘牡丹香气基因资源和开发利用牡丹价值提供理论基础。现阶段关于牡丹的花香成分释放规律、花香遗传规律、不同花香成分生物合成途径以及挥发性成分的嗅觉阈值等方面的研究内容均较少,在后续研究中可进一步结合各挥发性成分的嗅觉阈值对牡丹花香特征进行鉴定与评价。