郑蕾，马龙，牛曼思，向玲，屠婷瑶，贾俊杰，郑焱丹，王世宽，沈才洪*

（1.四川轻化工大学生物工程学院，四川自贡 643000；2.泸州品创科技有限公司/国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州 646000；3.泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646000）

中国白酒是世界六大蒸馏酒之一[1-2]，与其他蒸馏酒相比，白酒的工艺复杂，原料来源丰富，品类繁多且风格独特[3]。根据不同的生产工艺及风味特征，白酒分为十二种香型，其中酱香型白酒是四大基本香型之一[4]。酱香型白酒经九次蒸煮、八次发酵、七次取酒、高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温馏酒等特殊工艺酿制而成[5]，其酿制周期长，具有“酱香突出、幽雅细腻、回味悠长、空杯留香持久”的感官特点[6]，因此酱香型白酒广受消费者欢迎。自然环境是白酒酿造的重要影响因素之一[7]，白酒的风味特征也在一定程度上受地理位置的影响[8]。

酱香型白酒被认为是十二大香型白酒中风味物质组成最为复杂的[8]，其主体香仍不清楚[9]。挥发性风味物质在酱香型白酒香气中起着重要作用，并与酱香型白酒的质量高度相关[10]。白酒风味化合物的分析方法主要涉及风味化合物的提取、分离以及成分的检测[11]，常用的提取方法有直接进样法、固相微萃取（SPME）法和液液萃取（LLE）法等；气相色谱配备氢火焰离子化检测器（GC-FID）和气相色谱质谱联用（GC-MS）等仪器已广泛应用于白酒挥发性风味物质分离和检测[12]。直接进样法多用于测定分析白酒中含量较高的骨架物质成分；SPME 多适用于异嗅化合物[13-14]、萜烯类化合物[15]、吡嗪类化合物[16]、含硫化合物[17]等物质的提取检测；LLE 在一些极性较强的化合物或在某些风味物质定量处理中应用较多[18-21]。陈华明等[22]采用GCFID 和GC-MS 从成品酱香型白酒中分别定量出45种化合物（醇醛酯类）和21种含氮化合物为主的风味物质，结合风味物质的香气活力值（OAV）确定了成品酱香白酒中的29种主要风味组分。

随着色谱技术的发展，研究者进一步阐明了白酒风味感官差异的物质基础，目前已有研究表明，利用GC-IMS、GC-FID、HS-SPME-GC-MS 和感官品评手段对四川、贵州、黑龙江以及河北的酱香型白酒进行检测分析，4 个产地的酱香型白酒在感官风味特征及挥发性化合物上均存在较大的差异[23-24]。由于企业间的工艺技术、勾兑技术相互学习，部分企业的酱香型白酒风味特征与该产地酱酒主要风味特征也会存在较明显差异[25]。因此本研究在酱香型白酒风味研究基础上，利用QDA、直接进样的香味提取技术结合GC-FID 进行感官评定和高含量的重要挥发性成分分析，采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）对贵州省遵义市仁怀市（RH）、贵州毕节市金沙县（JS）、四川省泸州市古蔺县（GL）以及黑龙江省齐齐哈尔市（QS）4 个产地的酱香型白酒进行研究，探究重要的差异性挥发性化合物，为酱香型白酒产品质量监控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

白酒样品：RH-1、RH-2、RH-3和RH-4（53%vol，购自贵州省遵义市仁怀市某公司），JS-1、JS-2 和JS-3（53 %vol，购自贵州省毕节市金沙县某公司），GL-1、GL-2、GL-3 和GL-4（53 %vol，购自四川省泸州市古蔺县某公司），QS-1、QS-2和QS-3（53%vol，购自黑龙江省齐齐哈尔市某公司）。

试剂：色谱级标准品：乙醛、异丁醛、丙酮、甲缩醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙缩醛、甲醇、2-甲基丁醛、异戊醛、乙醇、丙酸乙酯、异丁酸乙酯、乙酸丙酯、二乙酰、丁酸乙酯、2-丁醇、丙醇、异丁醇、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、丁醇、戊酸乙酯、2-甲基丁醇、异戊醇、己酸乙酯、戊醇、乙基糠基醚、乙偶姻、乳酸乙酯、己醇、糠醛、辛酸乙酯、苯甲醛、2,3-丁二醇（左旋）、2,3-丁二醇（内消旋）、1,2-丙二醇、糠醇、苯乙酸乙酯、苯乙醇、棕榈酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯（纯度均≥99 %），上海安谱实验科技股份有限公司。

内标物质：叔戊醇和乙酸正戊酯（纯度均≥99.5%），天津光复精细化工研究所。

仪器设备：气相色谱仪（GC-2010 Plus），岛津企业管理（中国）有限公司；DB-WAX 毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μ m），美国Agilent 公司；涡旋仪（S0200-230V-EV），美国Labnet 公司；万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；集中供水装置（PC-2RP-EDI），成都品成科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 感官评价方法

根据GB/T 10220—2012《感官分析方法学 总论》，品评小组构建：品评小组共6 人，20～35 岁，品评组成员均为具有3 年以上白酒品评经验（国家级/省级白酒评委）的尝评员。感官品评环境设定：设置在安静、通风、无味的白酒品评室，室内温度为20～25 ℃，湿度为60%左右，室内光线充足、柔和，墙壁没有强烈的反射。感官品评方式：暗码编组盲评法。

感官品评前先培训品评人员，熟悉感官描述词，按表1 列明的感官属性及相关感官描述词评定各感官属性的强度，评定分数为0～5 分，0 分表示未闻到，5 分为闻到的香气最强。通过计算评分确定其结果。

表1 酱酒竞品感官属性及描述语

表2 42种重要挥发性风味物质保留时间、标准曲线回归方程、相关系数和精密度试验

表3 不同产地酱香型白酒中挥发性化合物GC-FID定量结果 (mg/L)

1.2.2 GC-FID 分析参数

检测条件：进样口温度为250 ℃，进样体积为1 μ L，采用恒流的分离模式，分流比选择40∶1，载气为高纯氮气（≥99.95 %），柱前压力117.6 kPa，柱流量0.8 mL/min，线速度25.6 cm/s，吹扫流量3.0 mL/min，总流量35.8 mL/min，氢气和空气流量分别为40 mL/min 和400 mL/min，FID 检测器温度为250 ℃。

程序升温条件：35 ℃保持3 min，3 ℃/min 升温至80 ℃，保持1 min，5 ℃/min 升温至100 ℃，保持3 min，6 ℃/min 升温至160 ℃，随后以10 ℃/min 升温至230 ℃，保持17 min。

1.2.3 定性与定量分析

根据目前报道及前期实验，本研究对酱香型白酒中含量较高的重要挥发性香气成分采用GC-FID与配制的风味物质标准品保留时间进行定性分析。采用内标法定量，配制五个浓度梯度的风味物质标准品的混合溶液，以标准溶液各组分质量浓度与内标物质量浓度的比值（x）为横坐标，各组分峰面积与内标物质峰面积比值（y）为纵坐标，绘制内标定量法校准曲线。为验证方法的精密度，参照GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》方法，设计精密度实验。精密度实验用配制标准曲线第二浓度点的混合标准溶液在相同色谱条件下重复测定6 次，计算各组分的精密度相对标准偏差（RSD，%）[26]，结果如表2 所示。

1.2.4 香气活力值（Odor Activity Value,OAV）的计算

阈值是风味化学中连接化学含量与感官特性的桥梁，识别阈值是风味化学中研究关键香气成分重要性的参考指标。根据GB/T 33406—2016《白酒风味阈值测定指南》中的十杯法（Ten Sample Test,TST法）及ASTM 标准E1432 中的最佳估计阈值法（Best Estimate Threshold,BET法）测定挥发性成分的香气阈值（Odor Threshold,OT），按照公式（2）计算OAV[22]。

式中：c 表示挥发性成分质量浓度，mg/L；A 表示挥发性成分气味OT，μ g/L。

OAV≥1，则表示气味的贡献值较大[27]，OAV＜1，则代表该风味物质在样品中对风味的贡献较小。

2 结果与分析

2.1 不同产地酱香型白酒感官评定结果分析

利用感官定量描述分析结果绘制感官雷达图（图1），单因素方差分析结果表明，不同产地白酒在陈香、曲香、酱香、醛香、果酸香、烘焙香、粮香、酯香、果酸味、甜味、咸味、鲜味、柔和度、细腻度、丰满度和舒适度感官属性存在显著性差异（p＜0.05）。在香气上，GL 产地酱酒样品以陈香、青草香、花果香为主，有明显酱香，曲香相对较弱，整体香气偏清雅；QS 产地酱酒样品呈现以粮香、酯香、糟香为主，酱曲香相对不明显，整体香气强度较弱；贵州省的酱酒样品以酱香、糟酸香、烘焙香为主，有明显坚果香和窖底香，整体香气浓郁，其中RH 产地样品以陈香、曲香、酱香、果酸香为主，有明显烘焙香和坚果香，整体香气强度较GL 产地更强；JS 产地酱酒样品以酱香、粮香、醛香为主，有明显糟香和辛香料香气，酱香和醛香较突出。

在口味上，不同产地的样品均以酸味和甜味为主，带有涩味，略有咸味和苦味，RH 产地样品的果酸味和鲜味较突出；QS 产地酱酒样品相较于其他产地酸味和甜味强度更弱，苦味较强；JS 产地样品以酸味为主，甜味较明显，略有咸味；GL 产地样品以甜味为主，酸味较明显，略有苦味，可能是四川纬度较高，气候相对更加温和，加之四川大环境以浓香型白酒为主，川酱自然也带有一些浓香型白酒的“甜感”[28]。在口感上不同产地的酱酒各有特色，GL 产地样品口感的柔和度和舒适度较高，RH 产地样品口感的细腻度、柔和度、丰满度以及整体的舒适度都较好，JS 产地样品口感的细腻度和舒适度较高，QS 酱酒样品表现为酒体舒适度较高，而细腻度、丰满度、柔和度较低，这三项指标与酸味、甜味、苦味三者的平衡感有较大的关系。

2.2 不同产地酱香型白酒GC-FID 数据分析

按照上述定性定量方法，采用直接进样的方法，通过GC-FID 对14 个酱香型白酒样品的42种较高含量风味物质进行了数据采集，各样品对应的风味物质含量如表3 所示。

对不同产地的14 个样品中各类（除醇醛酯类外，剩余的记为其他类）风味物质含量及其占比做了柱状图分析（图2）。从图2A 可以看出，不同产地样品风味物质的总含量存在一定的界限。QS 产地样品的风味物质含量远低于其他3 个产地，JS 产地的样品风味物质含量最高，造成这两个产地差异的原因主要在于两个产地的醇类总含量差异；RH 产地、QS 产地和GL 产地的酯类含量在4000 mg/L 左右；GL 产地的醛类物质含量高于其他3 个产地。从图2B 中可以看出，产自贵州省的酱香型白酒（RH 产地和JS 产地）的其他类物质占比高于GL 产地和QS 产地。

图2 不同产地酱香型白酒样的风味物质种类总含量分布（A）和百分比分布（B）

聚类分析可以更好的了解不同样品的分类问题以及观察样品不同风味物质的差异[29]。为了比较不同产地酱香型白酒风味物质之间的差异，对不同产地14 个酱香型白酒样品的风味物质数据采用标准分数的方式处理后进行差异比较与聚类，结果如图3 所示。从整体上来看，JS 产地的风味物质对应的颜色最深，QS 产地的颜色最浅，对应的风味物质总含量最高和最低，与图2A 结果相对应。RH 和JS 产地酒样的一些高沸点风味物质，如苯乙酸乙酯、棕榈酸乙酯、油酸乙酯和亚油酸乙酯等要高于GL 和QS 产地。RH 产地样品中的乙偶姻、2,3-丁二醇（左旋）和乙基糠基醚显著高于其他3 个产地；JS 样品风味物质的含量虽然整体水平最高，但是其乙酸乙酯却是所有产地中最低的；丁酸乙酯和戊酸乙酯在QS 产地的含量普遍高于其他3 个产地；GL样品中的辛酸乙酯、己酸乙酯、甲缩醛、乙缩醛、甲酸乙酯和乙醛等这些出峰早的小分子风味物质远高于其他3 个产地。

图3 气相检测不同样品风味物质含量聚类热图

图4 GC-FID 检测不同样品的风味物质含量的PCA 分析（A）和OPLS-DA 分析（B）

图5 气相检测不同样品风味物质含量的VIP图

图6 GC-FID 定量的风味物质OAV 热图

主成分分析和正交偏最小二乘判别分析可以可视化的对比不同组别间的差异。主成分分析是一种无监督进行数据降维的方法，将多个原始参数化为少数几个新指标，并能最大限度保留样本原始信息[30]，有监督的正交偏最小二乘法判别分析可以更准确的检测到不同产地间差异及差异风味化合物。对不同产地样品风味物质成分的GC-FID 数据进行了PCA 和OPLS-DA 分析，如图4 所示。从PCA 分析中（图4A）可以看出PC1+PC2＞50 %，前两个主成分已经可以解释大多数数据。QS 产地和RH 产地对应的样品较为集中；JS 产地和GL 产地类似，样品较为分散，其中JS-2 与GL-4 远离同产地的其他样品。通过有监督的OPLS-DA 分析可以看出（图4B），各个产地的样品都相对集中，和其他产地有明显的区分。贵州省两个产地之间的样品也较为相似，基本上分布在第四象限；QS 产地的样品分布在第三象限；GL 的样品分布在y 轴正半轴。

变量重要性投影（VIP）可以衡量样品间变量的贡献大小，VIP 值越大，说明该变量对样品组间分类判别的影响强度和解释能力越强，因此可以根据建立的正交偏最小二乘判别模型变量重要性投影值计算各品质性状重要性。进一步根据OPLS-DA生成的VIP 值筛选不同产地间差异成分，如图5 所示。对4 个产地酱香型白酒风味物质成分进行组间比较发现，VIP＞1 的差异化合物共有18种，其中酯类物质有9种，醇类物质6种，醛类物质1种，其他类2种。可以看出醇类和酯类化合物是造成不同产地样品间重要差异的风味物质，也表明醇类和酯类对酱香型白酒具有重要的贡献[10]。

通过查阅相关资料和阈值测定实验，结果表明甲醇和1,2-丙二醇溶于53 %vol 乙醇溶液中，只能闻到乙醇的味道，缺乏相关的阈值数据[27]。结合气相色谱的定量结果和阈值测定结果，计算出了14个样品中剩余的40种风味物质的OAV 并列入表4中，采用取log10（原始数据+0.01）的缩放方式处理后进行聚类分析，绘制了相关热图（图6），颜色越深表明该风味物质对样品的风味贡献越大。从图6可以直观看出，乙醛、戊酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙缩醛、乙酸乙酯、异丁酸乙酯和棕榈酸乙酯对所有样品的风味物质都具有重要贡献；乙基糠基醚、糠醇、戊醇、甲酸乙酯、甲缩醛、2-甲基丁醇、糠醛、苯甲醛、2,3-丁二醇（左旋）和2,3-丁二醇（内消旋）对整体风味物质贡献最低。值得一提的是，除QS 产地的样品外，2-甲基丁醛对其他三个产地的样品风味都具有较大的贡献；并且2-甲基丁酸乙酯、异丁醛、苯乙酸乙酯、乙酸丙酯和二乙酰等对QS 产地的贡献显著低于其他3 个产地。

表4 不同产地样品风味物质的OAV

3 结论

本试验对贵州省遵义市仁怀市、贵州省毕节市金沙县、四川省泸州市古蔺县以及黑龙江省齐齐哈尔市四个产地的酱香型白酒进行评定和检测，结果表明四个产地在酱酒香气特征中的陈香、曲香、酱香、醛香、果酸香、烘焙香、粮香、酯香和口感特征中的果酸味、甜味、咸味、鲜味、柔和度、细腻度、丰满度和舒适度的特征上均存在显著性差异（p＜0.05），RH 产地酱酒的陈香、曲香、酱香、果酸香较突出，JS 产地酱酒样品酱香、粮香、醛香较突出，有明显糟香和辛香料香气，GL 产地酱酒粮香、青草香、花果甜香和甜味较突出，QS 产地样品粮香、酯香、糟香较突出，酱曲香相对不明显，所呈现的感官属性与GL 产地的相似，但香气强度相对较弱。利用GC-FID 从样品中定性和定量出42种含量较高的挥发性成分，并通过PCA 和OPLS-DA 分析，贵州、四川、黑龙江三省4 个产地的酱香型白酒样品距离较远，在风格特征上自成派系且在风味物质成分上均有一定的差异。通过筛选OAV 值发现，乙醛、戊酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、异戊醛、丙醇、丁醇、乳酸乙酯、苯乙醇、乙缩醛、乙酸乙酯、异丁酸乙酯和棕榈酸乙酯这13种风味物质对所选样品的风味贡献程度都很高（OAV＞10）。VIP＞1 的差异化合物共有18种，其中酯类物质有9种，醇类物质6种，醛类物质1种，其他类2种。在OAV 和VIP 两种手段筛选出的重要风味物质中，醇类和酯类占比最高，验证了醇类和酯类对酱香型白酒香味具有重大贡献的说法。本次研究更加细化了不同产地酱香型白酒的感官特征及风味物质成分的差异，为酱香型白酒生产过程及产品质量监控提供了科学依据。