张平香 魏朝辉, 郑程鹏, 张浔 张棋 蒋佳辉 罗杨志 喻运珍, 艾桃山, 张立强, 朱文欢 黄天乐 邓平,

(1 武汉市农业科学院,武汉 430207; 2 武汉中博水产生物技术有限公司,武汉 430070; 3 华中农业大学水产学院,武汉 430070; 4 洪湖市水产发展中心,湖北洪湖 433200; 5 武汉市水产技术推广指导中心,武汉 430014)

黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)俗称黄腊丁,是一种底栖小型杂食性鱼类,是我国重要的名优养殖品种之一。近年来,黄颡鱼的养殖产量逐年增加,据报道,2003—2018年我国黄颡鱼养殖产量的年平均增长速率达16.38%,2018年全国黄颡鱼养殖总产量约为50万吨,占全国淡水养殖鱼类总产量的2%左右,产地主要集中在湖北、湖南、四川、广东等地[1]。随着黄颡鱼养殖规模不断增加,养殖密度增大,病害问题越来越显现出来,尤其是由细菌引起的细菌性疾病严重。养殖水体恶化,养殖户盲目使用药物,也使得病害问题愈加严重。据不完全统计,细菌性疾病每年给黄颡鱼养殖带来上亿元的经济损失。

维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)隶属于弧菌科、气单胞菌属(Aeromonas),在生态系统中广泛存在[2],已被确认为水产动物的原发性或继发性病原[3-7]。1989年,首次从乌鳢身上分离得到维氏气单胞菌[8],之后陆续在观赏鱼[9]、欧洲海鲈(Dicentrarchuslabrax)[10]、团头鲂[11]、黄鳝[12]、中华绒螯蟹[13]及黄颡鱼[14]中分离得到,主要症状为体表溃疡出血,腹水,脾肾结节、肿大等。维氏气单胞菌是养殖黄颡鱼常见的病原菌之一。

本研究对湖北省某养殖场的患病黄颡鱼进行病原分离,得到了1株致病菌株。通过对其进行形态学观察、16S rRNA基因序列测定,确定该菌株为维氏气单胞菌。同时,选取诃子、五倍子、穿心莲、乌梅、连翘、五味子、秦皮、鱼腥草、牡丹皮、青蒿等10种具有较好抑菌效果的中草药,测定这10种中草药对该菌的抑菌效果,旨在为用中草药防治维氏气单胞菌病提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 病料来源

患病黄颡鱼采自湖北省某养殖场。病鱼主要表现为漫游,体表溃疡出血,腹水。在无菌条件下取样病鱼的肝脏、脾脏,进行实验室病原分离培养。

1.2 试剂和材料

BHI培养基(脑心浸液肉汤)购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。10×Buffer(缓冲液)、dNTP、TaqDNA聚合酶、切胶回收试剂盒、pMD18-T Vector载体及大肠杆菌DH5α感受态细胞均购自宝生物工程(大连)有限公司。所有化学试剂均为进口或国产分析纯。实验相关引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成,核酸序列测序均由天一辉远生物科技有限公司完成。

10种中草药(诃子、五倍子、穿心莲、乌梅、连翘、五味子、秦皮、鱼腥草、牡丹皮、青蒿)来自武汉中博水产生物技术有限公司。盐酸多西环素与氟苯尼考购自上海沃凯药业有限公司。

1.3 病原菌的分离与纯化

取具有典型症状的濒死黄颡鱼,经体表消毒后,于无菌条件下分别取其肝脏和肾脏涂于BHI琼脂平板上并划线,28 ℃培养24 h后,挑取单个菌落于相同条件下进行纯化培养。在纯化后的培养物中挑取单个菌落进行扩大培养,加装甘油(终浓度为50%)于-80 ℃保存备用。将获得的单一形态的菌株命名为H1。

1.4 16S rRNA基因序列分析

实验采用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取细菌DNA。提取后的细菌DNA经核酸电泳验证后,置于-20 ℃冰箱保存。扩增引物为[15]:16S-F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,16S-R:GGTTACCTTGTTACGACTT。反应总体系25 μL:DNA模板0.5 μL,上、下游引物各1 μL,10×Buffer 2.5 μL,dNTP 2.5 μL,TaqDNA聚合酶0.2 μL,去离子灭菌水17.3 μL。

16S rRNA基因扩增反应条件为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共34个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,回收目的片段,进行T载体克隆,并对重组质粒进行测序。测序结果比对拼接后在NCBI上在线分析。

1.5 系统发育树的构建

将菌株H1与其他气单胞菌属的16S rRNA核酸序列进行比较分析,利用Clustal X软件进行比对排列,采用MEGA 6.0软件进行系统发育分析,用Neighbour-joining方法和Kimura 2-parameter校正软件进行同源性比较并构建系统发育树,并通过自举分析(Bootstrap)进行1 000次重复检测,分析系统的置信度。

1.6 中草药水提液制备

10种中草药分别为:诃子、乌梅、连翘、五倍子、五味子、秦皮、鱼腥草、牡丹皮、青蒿、穿心莲。

中草药水提物制备[16]:将10种中草药各称取10 g分别放入烧杯中,加水煎煮2次,每次煮沸30 min,集中2次煮出的药液进一步煎煮,浓缩至10 mL,浓缩液经高压灭菌后置于4 ℃冰箱保存备用。

1.7 最低抑菌浓度的测定

根据水产抗菌药物抗菌作用的测定方法,采用两倍稀释法,于第1支装有1 mL无菌液体培养基的试管中加入供试原药液1 mL,充分混合后,取出1 mL加入第2支试管中,依次类推至第14支试管,从第14支试管中取出1 mL弃去,第15支试管不加药物,为对照管。在每支试管中加入配置好的H1菌液0.1 mL,充分混匀后,置于28 ℃恒温条件下培养24～48 h,经肉眼观察证实无菌生长的试管中的药物浓度,即为该药物的最低抑菌浓度(MIC,minimum inhibitory concentration)。每种中草药设3个平行组,最低抑菌浓度的结果取其平均值。

1.8 数据统计分析

试验数据采用 SPSS 25.0 软件进行统计和分析比较,结果以(平均值±标准差)表示。

2 结果

2.1 病原菌的纯化分离

H1菌落呈灰白色,半透明,圆形,中间隆起,边缘整齐,表面湿润、光滑。经革兰氏染色后呈红色,为革兰氏阴性菌(见图1)。

图1 分离株的平板菌落及革兰氏染色图

2.2 16S rRNA序列分析

采用试剂盒提取H1菌株的DNA,以其为模板进行16S rRNA基因的PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,获得的目的片段长约1 500 bp(见图2)。

注:Marker为DNA分子质量标准;H1为H1菌株的16S rRNA PCR产物。

2.3 系统进化分析

将测序结果在NCBI中在线比对,结果表明,菌株H1所测序列与维氏气单胞菌(A.veronii)的同源性很高。从最相近的同源性较高的气单胞菌属序列中进行选择,并以大肠杆菌和爱德华氏菌为外群,进行系统发育树的构建。结果显示,菌株H1与A.veronii(MT228974.1、MG063203.1)聚为一支(见图3)。

图3 以菌株H1的16S rRNA基因序列构建的系统发育树

2.4 最低抑菌浓度

10种中草药以及盐酸多西环素、氟苯尼考对维氏气单胞菌H1菌株的抑菌结果见表1。从表1中可以看出,诃子、五倍子、穿心莲有较好的抑菌效果,其中诃子的抑菌效果最好;乌梅、连翘、五味子、秦皮、鱼腥草、牡丹皮、青蒿的抑菌效果较差,其中五味子的抑菌效果最差。

表1 药物对H1菌株的最低抑菌浓度

3 讨论

中国具有全球最大的水产养殖规模,同时也面临着严峻的鱼类病害问题。由于养殖病害问题逐年增加,抗生素等药物滥用等导致的水环境污染、细菌耐药性增加及食品安全等一系列问题[17-18]严重制约了水产健康养殖的发展,因此,开发能有效防治疾病且对环境友好的药物对水产养殖具有重要意义。

中草药具有天然性、安全性、低值高效性,其含有的糖类、有机酸、生物碱、苷类和挥发油等物质具有抗菌杀菌作用[19]。本研究以诃子、乌梅、连翘、五倍子、五味子、秦皮、鱼腥草、牡丹皮、青蒿、穿心莲等10种中草药水提物为研究对象,检测其对维氏气单胞菌的抑菌效果,结果显示,诃子、五倍子、穿心莲有较好的抑菌效果,其中诃子的抑菌效果最好;乌梅、连翘、五味子、秦皮、鱼腥草、牡丹皮、青蒿的抑菌效果则较差。张生元等[20]采用以上10种中草药对柱状黄杆菌的抑菌试验结果表明,诃子抑菌效果最好,连翘、乌梅和五倍子抑菌效果次之,而五味子、秦皮、鱼腥草、牡丹皮、青蒿、穿心莲的抑菌效果较差;晋鹏飞等[21]研究发现,诃子和五倍子的提取物对嗜水气单胞菌具有较好的抑菌效果;张桓桥等[22]的研究表明,中草药复方(五倍子∶地榆∶诃子∶苏木∶黄芩∶黄连=4∶4∶2∶5∶3∶1)具有较好的抑菌效果。以上报道与本研究结果基本一致。

现代药理学的研究表明,诃子、五倍子、穿心莲的提取物都具有抗菌作用[23-25]。诃子所含的三萜类成分、五倍子所含有的鞣酸、穿心莲所含有的二萜内酯类化合物具有显著的抗菌作用[26-28],与本研究的结果相符合。因此,有必要对诃子、五倍子、穿心莲复配的抑菌效果进行研究,以期开发出高效、低副、无毒的复方中草药,发挥中草药在水产养殖生物细菌性疾病防治中的重要作用。