张 越, 沈 文, 罗广文, 徐静文

(陕西科技大学 食品科学与工程学院(生物与医药学院), 陕西 西安 710021)

0 引言

多酚是植物体内的复杂酚类次生代谢物,具有多元酚结构,主要存在于植物的皮、根、叶和果肉中,含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素,其多元酚结构具有独特的理化性质,如能与蛋白质、生物碱、多糖等结合,能与金属离子络合,具有还原性、捕捉自由基的活性和诸多衍生化反应活性等,因而广泛应用于农业、生态环境、食品、医药等领域[1].

槲皮素作为一种重要的多酚类化合物,具有抗高血压、抗糖尿病、抗哮喘、抗癌、抗病毒和抗氧化等药理活性[2],但其自身的平面型分子结构导致其亲水性及亲脂性差、化学稳定性差、生物利用率低,限制了其在食品、医药等方面的应用.目前,基于提高槲皮素稳定性和生物利用率的口服递送体系很多,如槲皮素纳米胶束[3]、槲皮素纳米粒[4]等,这些递送体系对槲皮素提供了初步保护,在一定程度上提高了槲皮素的稳定性及生物利用度,但依旧存在一些问题,例如:

(1)传统口服递送体系大多通过氢键、电荷作用等非共价键与槲皮素相结合[5],因非共价作用易受胃肠道的酸性环境及其含有的离子等影响,因此体系的稳定性很不理想;(2)传统载体大多不耐酸,在胃肠液中稳定性差,滞留时间较短,难以实现高效肠靶向递送;(3)已有研究表明,肠道炎症发生时,会大量分泌ROS[6],而ROS大概率会将槲皮素氧化成醌失效,因此槲皮素在肠道释放后是否依旧具有活性尚未可知.目前亟待构建耐酸,抗氧化型槲皮素高效肠道靶向递送体系.

魔芋葡甘聚糖(KGM)是一类由植物魔芋块根中萃取出的水溶性多糖,是目前所知道的黏度最高的一类植物多糖,具有抗氧化、提高免疫力、改善血糖、血脂水平等多种功效[7].因KGM在体内可降解且具有良好的生物相容性,近年来被越来越多地用作药物载体[8-10].

据报道,巯基化载体可以通过与肠黏液中黏蛋白上的巯基形成二硫键而实现肠道黏附[11],含硒化合物可以提高体内谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的水平,防止自由基的积累,进而发挥ROS清除的功能[12].基于此,本研究采用硒化魔芋葡甘聚糖(SeKGM)和巯基化海藻酸钠(TSA)为原料,乳酸钙为交联剂,构建了一种耐酸、ROS自清除型槲皮素口服肠道靶向递送体系,为槲皮素等多酚营养素的高效肠道靶向递送提供了新的思路.

1 实验部分

1.1 材料与试剂

槲皮素(96%,上海贤鼎生物科技有限公司);魔芋葡甘聚糖(90%,深圳盛海生物工程有限公司);海藻酸钠(黏度200±20 mPa·s,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);巯基乙醇酸(90%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);乳酸钙(98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);黏蛋白(猪胃黏膜素,BR,上海麦克林生化科技公司);硫酸亚铁(90%,上海麦克林生化科技公司);水杨酸(99.5%,上海麦克林生化科技公司);无水乙醇(天津科密欧化学试剂有限公司).

1.2 仪器与设备

Multiskan SkyHigh全波长酶标仪(赛默飞);VECTOR-22傅里叶变化红外光谱仪(德国布鲁克);激光粒度Zeta电位仪(奥地利安东帕);FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN 透射电子显微镜(美国FEI);KH5200DE型数控超声波清洗器(昆山禾制超声仪器有限公司).

1.3 Ca2+交联耐酸、耐氧化的槲皮素载体的构建

1.3.1 硒化魔芋葡甘聚糖(SeKGM)的制备

称取0.50 g魔芋葡甘聚糖(KGM)将其溶于50 ml 0.5%(v/v)硝酸溶液中,充分溶解后加入0.86 g Na2SeO3和0.61 g BaCl2,混匀后置于60 ℃中反应8 h,冷却至室温后向反应液中加入0.50 g无水硫酸钠搅拌均匀,产生白色沉淀;将该悬浊液离心后取上清液,加入碳酸氢钠使其中和至中性后加入足量乙醇产生白色沉淀,经离心弃去上清液,将沉淀在50 ℃下真空干燥3 h,得到最终产物[12].(产率:36.4%)

1.3.2 巯基化海藻酸钠(TSA)的制备

将1.00 g海藻酸钠(SA)加入到20 mL水中溶解为均质溶液,向该溶液中缓慢加入1.30 mL巯基乙醇酸;并将1 mL浓度为10 M的盐酸逐滴加入至反应液使其酸化后置于60 ℃中反应3 h.反应完成后将其缓慢加入足量甲醇产生白色沉淀,离心后弃去上清液得到产物(产率:50.8%)[13].

1.3.3 钙离子交联硒化魔芋葡甘聚糖-巯基化海藻酸钠(SeKGM-TSA/Ca2+)微凝胶的制备

将1 mL的SeKGM溶液缓慢加入3.5 mL的TSA溶液中,混合均匀后室温搅拌12 h,后将1 mL上述混合液逐滴加入到12 mL乳酸钙溶液中,滴加完毕后继续搅拌5 h,离心后取其上清液,即为SeKGM-TSA/Ca2+微凝胶.

1.3.4 负载槲皮素的钙离子交联硒化魔芋葡甘聚糖-巯基化海藻酸钠(SeKGM-TSA/Ca2+@Q)微凝胶的制备

取槲皮素溶液(1 mL)加入至3.5 mL的TSA溶液中,混合均匀后向其中加入1 mL SeKGM溶液,混合均匀后将其置于室温下搅拌12 h后将1 mL上述混合液逐滴加入12 mL乳酸钙溶液中,滴加完毕后室温下搅拌5 h,离心后取其上清液,冷冻干燥后即得SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶.

1.4 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶的结构表征

采用傅里叶红外光谱(FT-IR)来确证微凝胶的成功制备,采用透射电子显微镜(TEM)和激光粒度Zeta电位仪观察微凝胶的微观形态和Zeta电位(ζ).

1.5 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶包载行为研究

1.5.1 槲皮素标准曲线的测定

将槲皮素置于容量瓶中,配制成浓度范围在1～15 μg mL-1的标准曲线,在374 nm处测定其吸光度,对槲皮素标准溶液的紫外吸光度(A)和浓度(C)进行线性拟合,得到如公式(1)所示的标准曲线:

(1)

1.5.2 SeKGM-TSA/Ca2+@Q对槲皮素的包载行为

取适量SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶冻干粉末研碎后,将其溶于10 mL水中,以40 W的频率超声30 min进行破壁.结束后取1 mL超声液置于10 mL容量瓶中,用50%乙醇溶液定容.用酶标仪测定稀释液在374 nm处的吸光度.按照式(2)计算微凝胶的载药量,式(3)计算微凝胶包封率:

(2)

(3)

式(2)、(3)中:We表示包封于微凝胶中的槲皮素质量,Wm表示微凝胶的总质量,W为体系中加入的槲皮素总量.

1.6 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶对·OH的清除效果测定

体外模拟胃肠道消化产物的制备:将负载有槲皮素的微凝胶(3 mg·mL-1)溶解在模拟胃液中(胃蛋白酶3.2%,NaCl 2%,浓盐酸调节pH至1.2),37 ℃下100 rpm搅拌2 h后用1M NaOH调节pH至7.4,加入等比例胰蛋白酶继续搅拌4 h,即得.

采用Fenton试剂法[14]分别检测①槲皮素(Q)、②TSA、③SeKGM、④TSA-SeKGM/Ca2+、⑤TSA-SeKGM/Ca2+@Q和⑥体外模拟胃肠道消化载药微凝胶(Digested products)对·OH的清除效果.将槲皮素(Q)、TSA、SeKGM、TSA-SeKGM/Ca2+、TSA-SeKGM/Ca2+@Q、体外模拟胃肠道消化载药微凝胶(Digested products)均配制成浓度为3 mg·mL-1的样品溶液.将9 mM硫酸亚铁溶液(50 μL)、9 mM水杨酸-乙醇溶液(50 μL)和样品溶液(50 μL)置于96孔板中混合均匀后,加入50 μL 8.8 mM过氧化氢溶液启动反应,在37 ℃下反应0.5 h后测定其在510 nm波长处的吸光度.该实验阳性对照组为抗坏血酸(VC),空白对照组为蒸馏水,按式(4)计算样品对·OH的清除率:

(4)

式(4)中:A0为蒸馏水空白对照组的吸光度,AS为样品的吸光度,AC为等体积水杨酸-乙醇溶液代替硫酸亚铁溶液作为试剂的对照组.

1.7 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶肠道黏附行为研究

将黏蛋白溶解在三种不同pH值的等渗缓冲液中,浓度为0.2%(w/v)(pH 2.0、pH 6.8 和 pH 7.4).将SeKGM-TSA/Ca2+、SeKGM-TSA/Ca2+@Q以3 mg mL-1的浓度分散在上述黏蛋白缓冲溶液中,在37 ℃下振荡2 h.随后,将溶液以12 000 rpm的转速离心2 min,采用高碘酸希夫(PAS)比色法测量上清液中未结合的黏蛋白.同法测量黏蛋白标准品(0.01～2.5 mg mL-1)制备黏蛋白标准校准曲线.与样品结合的黏蛋白量(mg)为添加的黏蛋白总量与游离黏蛋白量之间的差值.

1.8 体外释放

以400 mL的模拟胃液/肠液作为体外释放介质.将60 mg的SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶复溶于5 mL的去离子水中,将其置于透析袋中,首先将其置于pH=2.0的磷酸盐缓冲液(人工胃液)中释放2 h,每隔1 h取一次样;后将透析袋迅速取出,置于pH=6.8的磷酸盐缓冲液(人工肠液)中释放3 h,每隔1 h取一次样;最后在pH=7.4的磷酸盐缓冲液(人工结肠液)中释放3 h,每隔30 min取一次样.每次取样时,补充同体积等pH释放介质.取样完成后,用50%的乙醇萃取游离槲皮素,并用酶标仪测定其在374 nm处的吸光度,按照式(5)计算各时间点累积释药率,并绘制SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶的释放曲线:

(5)

式(5)中:MT、MZ分别代表在第T小时释放出槲皮素的质量和释放开始时水凝胶中槲皮素的总量.

2 结果与讨论

2.1 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶的表征

2.1.1 红外光谱

巯基海藻酸钠(TSA)、硒化魔芋葡甘聚糖(SeKGM)、槲皮素(Q)和负载槲皮素的微凝胶(SeKGM-TSA/Ca2+@Q)的红外谱图如图1所示.

图1 SeKGM-TSA/Ca2+@Q、Q、SeKGM和TSA的傅里叶变换红外光谱图

海藻酸钠在巯基化后在2 668 cm-1处出现了巯基特征峰,表明巯基海藻酸钠已成功合成.魔芋葡甘聚糖在硒化后753 cm-1出现了亚硒酸酯的特征峰,说明硒化魔芋葡甘聚糖的形成.3 303 cm-1为槲皮素酚羟基特征振动峰,1 671 cm-1为α,β-不饱和脂肪酮的酮羰基的特征振动峰.当与乳酸钙交联后,C-H在2 895 cm-1和2 983 cm-1处的对称和非对称伸缩振动强度减弱,并且,在1 734～1 130 cm-1区域出现的所有峰都向低波数区域移动,峰的强度减弱是空间效应的结果,表明乳酸钙与TSA与SeKGM成功交联,蛋壳结构形成,槲皮素成功负载.

2.1.2 粒径与Zeta电位

激光粒度Zeta电位仪测定结果如图2(a)所示,SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶的流体力学直径(Dh)为211.7±3.03 nm,多分散指数(PDI)为0.167±0.009,粒度分布呈现单峰,表明微凝胶分布均匀.Zeta电位测定结果如图2(b)所示,TSA和SeKGM的Zeta电位分别为-22.3±1.7 mV、-10.8±0.9 mV,槲皮素自身基本不带电,且空白微凝胶(SeKGM-TSA/Ca2+)与负载槲皮素后的微凝胶(SeKGM-TSA/Ca2+@Q)相比,电位变化不大,可间接证明槲皮素已被成功负载.

图2 微凝胶及其中间体的粒径分布及zeta电位

2.1.3 透射电镜

透射电镜观察结果如图3所示.结果表明,SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶为球状、分布均匀的球形,直径为88.8±13.56 nm.说明该微凝胶可穿透肠道黏液层[15].

图3 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶的透射电镜图

2.2 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶对槲皮素的包载行为分析

SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶对槲皮素包载行为测定的结果表明,微凝胶平均载药率为5.24%,包封率为80.46%,表明SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶对槲皮素的负载能力良好[16].

2.3 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶对·OH的清除效果

由图4可知,游离槲皮素(Q)、巯基化海藻酸钠(TSA)和硒化魔芋葡甘聚糖(SeKGM)对·OH的清除率分别为19.3%±1.79%、37.8%±0.85%和33.1%±1.09%,空白微凝胶(SeKGM-TSA/Ca2+)对·OH的清除率为43.0%±1.58%,表明该体系具有自主ROS清除效果.负载槲皮素后的微凝胶(SeKGM-TSA/Ca2+@Q)对·OH的清除率可达50.2%±1.12%,与游离槲皮素相比,·OH清除能力显著提高.除此之外,微凝胶经体外模拟胃肠液消化后,·OH清除率仍高达80.8±0.96%,为实现槲皮素的稳定肠靶向递送提供了结构基础.

2.4 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶的肠道黏附性能

在pH 2.0、6.8和7.4的条件下,通过对黏蛋白的体外黏附来评估微凝胶的黏附行为,结果如图5所示.空白凝胶(SeKGM-TSA/Ca2+)在pH 2.0、6.8、7.4下黏蛋白的黏附量分别为74.3±0.79 mg、111.9±0.20 mg、141.0±0.46 mg;负载槲皮素后的微凝胶(SeKGM-TSA/Ca2+@Q)在pH 2.0、6.8、7.4下黏蛋白的黏附量分别为94.1±0.37 mg、145.6±0.79 mg、162.0±0.53 mg.结果表明,微凝胶对黏蛋白有良好的黏附效果,这是由于巯基可以与肠黏液中黏蛋白的巯基形成二硫键,从而使微凝胶在肠道中的作用时间延长.并且,负载有槲皮素的微凝胶(SeKGM-TSA/Ca2+@Q)对黏蛋白的黏附效果更好,这可能是因为其表面的槲皮素与黏液存在氢键和静电作用.

图4 Q、TSA、SeKGM、SeKGM-TSA/Ca2+和SeKGM-TSA/Ca2+@Q、体外模拟胃肠道消化载药微凝胶(Digested products)对·OH的清除效果

图5 SeKGM-TSA/Ca2+和SeKGM-TSA/Ca2+@Q对黏蛋白的黏附能力

2.5 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶的体外释放

采用透析法测定SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶在不同pH下的体外释药行为.结果如图6所示,SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶在模拟胃液(pH=2.0)和模拟肠液(pH=6.8)中5 h累计释放量小于15%,而在模拟结肠液(pH=7.4)中迅速释放,最终累计释放量为56.7%±1.47%.结果表明,该微凝胶在胃肠部位对槲皮素具有良好的保护作用;当微凝胶进入结肠后,表面的钙交联层逐渐瓦解,最终完成槲皮素的结肠靶向释放.

图6 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶的体外释放曲线

3 结论

本文制备了一种耐酸、ROS自主清除型微凝胶(SeKGM-TSA/Ca2+@Q)用于槲皮素的高效肠道靶向递送.经FT-IR证实,SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶成功制备,且透射电子显微镜呈现出粒径为88.8±13.56 nm的球状结构,所构建的SeKGM-TSA/Ca2+、SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶对·OH的清除率分别为43.0%±1.58%和50.2%±1.12%,具有显著的ROS自主清除能力.此外,SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝胶对黏蛋白有很好的黏附能力,体外释放实验表明该体系可保护槲皮素免被胃酸破坏,最终槲皮素的肠靶向释放累积量为56.7%±1.47%.综上所述,该耐酸、ROS自清除型微凝胶可保护槲皮素免被胃酸腐蚀和胃肠道ROS氧化失效,实现槲皮素的高效肠道靶向递送.