张 童, 任 煜, 李 蕾, 裴 环, 蒙 慧, 吴月滢,2, 袁嘉丽,2*

(1.云南中医药大学 基础医学院, 云南 昆明 650000; 2.云南中医药大学 云南省中医药学分子生物学重点实验室 云南省中医药调节人体微生态创新团队, 云南 昆明 650000)

0 引言

抑郁症是常见的一种全球精神健康相关类的疾病,影响着全世界近3亿人,主要表现为情绪低落、失眠、对外界事物及活动失去兴趣等特征,严重患者甚至会自杀,我国抑郁症发病率逐年上升且发病率呈年轻化趋势[1,2].

持续性低度免疫炎症反应是重度抑郁症患者的病理特征之一[3].多项研究表明,肠道屏障功能损伤与炎症反应息息相关.肠道屏障主要有机械屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障四部分构成[4],可以有效的防止肠内有害物质进入其它的组织和器官.但当肠道屏障完整性遭到破坏,肠屏障通透性增加,肠内细菌移位,内毒素增加,导致肠内炎症,进而诱发的全身炎症反应可能是引起抑郁症的原因之一[5,6].目前临床治疗以五羟色胺再摄取抑制剂、三环类抗抑郁药和四环类抗抑郁药为主,但具有起效慢、服用周期长、副作用大等局限性[7].基于此,从中医药多靶点、多途径等特点入手,寻求更为有效且安全的治疗方法有极大的可行性.

玫瑰花,味甘微苦,温,归肝、脾二经,具有行气解郁,和血散瘀之效[8].现代药理研究表明,玫瑰花的主要活性成分有黄酮类、挥发油和芳香类、多糖类、多酚类、脂肪酸类及其他营养成分,具有抗抑郁、抗氧化、抑菌等作用[9].研究表明,玫瑰花颗粒可显著增加血清中的5-HT含量.改善CUMS小鼠的抑郁样行为[10].五味子,味酸、甘,性温,归肺、心、肾经,具有收敛固涩,益气生津,补肾宁心[8].药理研究表明五味子主要活性成分为木脂素、挥发油、多糖等,具有镇静催眠、抗抑郁、调节免疫、抑菌等作用[11].研究发现五味子提取物和五味子木脂素均可减轻LPS诱导模型小鼠中枢和外周的炎症,同时显著改善了模型小鼠的抑郁样行为[12].玫瑰花行气解郁,五味子补肾宁心,二药合用,增强其抗抑郁、抗炎的作用.目前,动物实验中多选择盐酸氟西汀作为阳性对照药物,盐酸氟西汀为5-HT再摄取抑制剂,通过结合5-HT受体来达到治疗抑郁症的作用,其作用部位为脑内.但本实验意在探讨药物通过修复肠黏膜屏障减轻炎症水平来缓解抑郁症,主要强调了肠道在抑郁症方面的作用靶点,因此未选择阳性药物作为对照.基于此,本实验探究了五味子及玫瑰花能否通过修复肠黏膜屏障减轻炎症从而改善小鼠抑郁样行为,为以后开发抗抑郁相关的保健品以及临床用药提供依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6雄性小鼠36只,体重18～20 g,4～6周龄,购自成都达硕实验动物有限公司,许可证编号:SYXK(滇)K2013-0007.小鼠饲养于云南中医药大学动物房,环境符合动物实验研究相关伦理学要求,独笼饲养,自由进食进水,光照12 h,平均温度(22±2) ℃.所有动物实验均经过云南中医药大学动物伦理实验委员会批准并按照其指导进行,伦理表编号:R-062021084.

1.2 实验药物、试剂与仪器

1.2.1 实验药物及试剂

玫瑰花和五味子均购于云南中医药大学校医院,五味子批次:20220201,玫瑰花批次:FY-MC820;五味子10 g,玫瑰花8 g,水煎剂.

小鼠IL-6 ELISA试剂盒(货号:MB-2899)、小鼠IL-1β ELISA试剂盒(货号:MB-2776)、小鼠TNF-α ELISA试剂盒(货号:MB-2868)、小鼠LPS ELISA试剂盒(货号:MB-3418)、小鼠5-HT ELISA试剂盒(货号:MB-3179)、小鼠BDNF ELISA试剂盒(货号:MB-2940),购自江苏酶标生物科技有限公司;Anti-ZO-1兔抗小鼠一抗(货号:GB111402)、Anti-Occludin兔抗小鼠一抗(货号:GB111401)、Anti-claudin1兔抗小鼠一抗(货号:GB112543),购自武汉赛维尔科技有限公司;山羊抗兔IgG HRP(批号:BL003A),Biosharp公司.

1.2.2 实验仪器

VisuTrack高端动物行为学分析系统由上海欣软信息科技有限公司提供;大小鼠旷场实验箱 上海欣软信息科技有限公司(型号:XR-XZ301);大小鼠强迫游泳实验箱 上海欣软信息科技有限公司(型号:XR-XQX202);小鼠束缚管自制;Synergy H1型多功能全波段酶标仪,Bio Tek 公司;台式高速冷冻离心机(5430R),Eppendorf;组织研磨仪,Bullet Blender Storm;Quant Studio实时荧光定量PCR仪,Applied Biosystems公司;BOX-F3凝胶成像系统,基因有限公司;GENE GNOME专业化学发光成像系统,XRQ公司.

1.3 动物分组

按照随机数字表法将36只C57BL/6雄性小鼠分成对照组(Control)、模型组(Model)、五味子及玫瑰花治疗组(S+R),每组12只.

1.4 模型复制与药物干预

除对照组外,模型组、五味子及玫瑰花治疗组采用CUMS联合孤养制备抑郁模型:应激源包含禁食(12 h)、禁水(12 h)、湿笼(12 h)、倾笼(12 h)、夹尾(1 min)、束缚(1 h)、夜间照明(12 h)、配对居住(12 h)等,每天随机采用2种应激源,同一应激源不得连续出现,每种应激源每周不超过2次.在造模第5周结束后进行行为学实验以判断是否造模成功,在造模第6周始给予五味子及玫瑰花(0.117 g/mL)进行灌胃干预,按照小鼠体重(10 g/mL),对照组和模型组小鼠分别给予0.9%的生理盐水灌胃,按照小鼠体重(10 g/mL),每天一次,连续灌胃14天.

1.5 检测指标

1.5.1 行为学检测小鼠行为学变化

造模期间每周测量小鼠的体重变化,造模结束后进行糖水偏好实验,旷场实验及强迫游泳实验测定小鼠行为学变化.

(1)小鼠体重:每周检测小鼠的体重变化.

(2)糖水偏好实验:在适应阶段,称取2瓶50 mL的1%的糖水置于鼠笼之上,自由饮水24 h.称取1瓶50 mL的1%的糖水和50 mL的饮用水置于鼠笼之上,自由饮水24 h.开始正式实验,小鼠禁食禁水24 h,将1瓶50 mL饮用水水瓶和1瓶50 mL 1%的糖水水瓶分别放于鼠笼,自由饮水3 h,3 h之后交换饮用水水瓶和糖水水瓶的位置,小鼠自由饮水3 h,最后拿下水瓶进行称量其内剩余量.

(3)旷场实验:将小鼠放入旷场箱内,在VisuTrack高端动物行为学分析系统内划分为3×3的九宫格,记录小鼠在旷场箱内的总路程,穿梭格子次数.

(4)强迫游泳实验:将小鼠放入游泳桶内,强迫游泳6 min,采用分析系统记录小鼠后4 min漂浮不动的时间.

1.5.2 Elisa检测小鼠海马内神经递质含量;血清内炎症因子表达水平

造模结束后,进行取材,断头去脑,分离海马组织,取血,离心得到小鼠血清.使用试剂盒检测海马5-HT、BDNF水平、检测血清IL-6、IL-1β、TNF-α和LPS水平,严格按照试剂盒说明书操作.

1.5.3 病理切片观察结肠组织炎症浸润程度及黏膜损伤程度

造模结束后,取结肠组织,进行HE染色,观察结肠组织炎症浸润程度及黏膜损伤程度.

1.5.4 Q-PCR检测结肠组织炎症水平

取0.05～0.06g结肠组织研磨后提取RNA,逆转录得到cDNA文库,在冰上配置SYBR Green预混液在实时PCR系统(Applied Biosystems)上根据说明书进行扩增.引物购于上海生工工程股份公司设计合成,序列见表1所示.

表1 LPS、IL-1β、TNF-α、IL-6引物序列

1.5.5 Western blot检测结肠黏膜紧密连接蛋白

称取0.06～0.07g结肠组织研磨,使用BCA蛋白测定法检测蛋白含量,分别制备15%、12%、6%的胶,电泳、转膜,封闭1 h,加入一抗4 ℃过夜,洗膜4次,二抗孵育1 h,再次洗膜4次,加ECL发光液拍照,分析图像.

1.6 统计方法

2 结果与讨论

2.1 各组小鼠体重变化

与对照组相比,模型组小鼠体重在造模期间体重增长率呈下降趋势;5周造模结束后,五味子及玫瑰花组与模型组相比,五味子及玫瑰花组小鼠体重无明显变化(p>0.05),具体见表2所示.

表2 小鼠造模期间体质量变化

2.2 各组小鼠行为学变化

本实验采用CUMS联合孤养复制抑郁模型,以此模拟社会复杂的应激源,其发病机制和表现更符合人类的发病原因[13].本实验采用糖水偏好实验、旷场实验、强迫游泳实验以评价小鼠的快感、自主行为和探究行为、绝望状态时间.

与对照组相比,模型组小鼠糖水偏好百分比,旷场实验总路程、穿越格子数水平显著降低(p<0.05);经五味子及玫瑰花药对治疗后,糖水偏好百分比,旷场实验总路程、穿越格子数水平显著上升(p<0.05).与对照组相比,模型组小鼠强迫游泳实验的漂浮时长显著上升(p<0.01);而经五味子及玫瑰花药对治疗后,漂浮时长显著下降(p<0.01).以上行为学结果提示,本实验复制模型成功,且五味子及玫瑰花药对可改善抑郁模型小鼠的抑郁样行为.因此,五味子及玫瑰花药对具有一定的抗抑郁作用.具体见表3和图1所示.

表3 各组小鼠行为学变化情况

图1 各组小鼠行为学变化情况(模型组与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01;治疗组与模型组比较,#p<0.05,##p<0.01)

2.3 各组小鼠海马组织5-HT、BDNF表达变化

研究表明,长期慢性应激状态下会导致下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamic-PituitaryAdrenal axis,HPA)轴持续亢进,使海马内5-HT以及BDNF的含量下降,从而引发抑郁症[14,15].

与对照组比较,模型组小鼠海马内5-HT、BDNF表达水平显著降低(p<0.01);经五味子及玫瑰花药对治疗后,海马内5-HT、BDNF表达水平显著上升(p<0.01).以上结果提示,五味子及玫瑰花药对可增加抑郁症模型小鼠海马内5-HT、BNDF等神经递质的表达.具体见表4和图2所示.

表4 各组小鼠海马内5-HT、BDNF的表达

图2 各组小鼠海马内5-HT、BDNF的含量变化情况(模型组与对照组比较,**p<0.01;治疗组与模型组比较,##p<0.01)

2.4 各组小鼠结肠组织HE染色

肠黏膜屏障受损,其完整性遭到破坏,肠内有害菌及其代谢物增多,肠源性LPS可透过受损的肠黏膜屏障入血,从而导致机体处于长期的慢性炎症中[16].

与对照组相比,模型组小鼠肠黏膜绒毛缺损或断裂,肠隐窝伴有炎细胞浸润,黏膜肌层变薄;经五味子及玫瑰花药对治疗后,肠黏膜腺体较完整,黏膜上皮细胞结构较完整,肠隐窝结构较清晰,炎细胞浸润减少.以上结果提示,五味子及玫瑰花药对对肠黏膜屏障完整性有一定的保护作用.具体见图3所示.

图3 小鼠结肠组织病理染色(HE染色,左列10×10,右列20×10)

2.5 各组小鼠结肠组织紧密连接蛋白变化

紧密连接蛋白Occludin、claudin1、ZO-1是肠黏膜机械屏障的基础结构,可维持其通透性.通过检测Occludin、claudin1、ZO-1蛋白发现,抑郁症模型小鼠结肠组织Occludin、claudin1、ZO-1蛋白表达水平显著降低(p<0.01);经五味子及玫瑰花药对治疗后Occludin、claudin1、ZO-1蛋白表达水平显著上升(p<0.05).以上结果提示,五味子及玫瑰花药对可一定程度上修复肠黏膜屏障的损伤.具体见表5和图4所示.

表5 Occludin、claudin1和ZO-1蛋白的相对表达水平

图4 各组小鼠中结肠组织Occludin、claudin1和ZO-1蛋白相对表达水平(模型组与对照组比较,**p<0.01;治疗组与模型组比较,#p<0.05,##p<0.01)

2.6 各组小鼠结肠组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA转录水平变化

长期慢性应激可导致大量的儿茶酚胺进入循环系统,引起肠黏膜的持续性损伤[17],肠黏膜完整性遭到破坏,肠源性内毒素入血,形成“肠漏症”[18],引起机体炎症水平升高,甚至引起血脑屏障通透性发生改变,进而影响海马内神经递质的含量.

与对照组相比,抑郁症模型小鼠结肠内的IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA转录水平显著升高(p<0.05);经五味子及玫瑰花药对治疗后,IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA转录水平显著降低(p<0.05).以上结果提示,抑郁症模型小鼠存在肠道炎症,且五味子及玫瑰花药对可缓解肠道炎症.具体见表6和图5所示.

表6 各组小鼠结肠内IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA转录水平

图5 各组小鼠结肠内IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的转录水平变化(模型组与对照组比较,*p<0.05,**p<0.01;治疗组与模型组比较,#p<0.05,##p<0.01)

2.7 各组小鼠结肠组织LPS mRNA转录水平变化

与对照组相比,抑郁症模型小鼠结肠内LPS mRNA转录水平显著升高(p<0.05);经五味子及玫瑰花药对治疗后,LPS mRNA转录水平显著下降(p<0.05).提示,由于肠道炎症,导致肠源性内毒素大量产生,且五味子及玫瑰花药对可减少肠源性内毒素的产生.具体见表7和图6所示.

表7 各组小鼠结肠内LPS mRNA转录水平

图6 各组小鼠结肠内LPS mRNA的转录水平变化(模型组与对照组比较,*p<0.05;治疗组与模型组比较,#p<0.05)

2.8 各组小鼠LPS入血情况

与对照组比较,模型组小鼠血清内LPS的表达水平显著升高(p<0.01);经五味子及玫瑰花药对治疗后,LPS的表达显著下降(p<0.05).具体见表8和图7所示.

表8 各组小鼠血中LPS的表达 (EU/L)

图7 各组小鼠LPS入血表达情况(模型组与对照组比较,**p<0.01;治疗组与模型组比较,#p<0.05)

2.9 各组小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α的水平变化

在抑郁症的发生发展中,由于肠黏膜屏障的损伤,导致机体的慢性低度免疫炎症反应一直伴随其存在,通过检测IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平发现,抑郁症模型小鼠血清中的IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平显著升高(p<0.01);经五味子及玫瑰花药对治疗后,IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平显著降低(p<0.05).具体见表9和图8所示.

表9 各组小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的表达 (pg/mL)

图8 各组小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的表达情况(模型组与对照组比较,**p<0.01;治疗组与模型组比较,#p<0.05)

3 结论

该实验结果显示模型组小鼠结肠组织紧密连接蛋白表达水平下降,结肠内炎症水平升高,肠源性内毒素入血引起全身炎症水平升高,海马内5-HT和BDNF的含量下降,经五味子及玫瑰花治疗后以上现象得到明显的改善,提示五味子及玫瑰花发挥抗抑郁作用的机制可能是通过修复肠黏膜屏障完整性,降低肠内炎症水平,减少肠源性内毒素入血,减轻全身炎症水平从而增加海马内5-HT和BDNF的含量.但肠黏膜屏障通透性改变往往伴随着肠道菌群及其代谢物的变化,而本实验中模型小鼠的肠道菌群及其代谢物的变化需进一步研究证实.

综上所述,五味子及玫瑰花药对具有抗抑郁作用,其作用机制可能与修复肠黏膜屏障,减少肠源性炎症介质的释放,增加海马内5-HT和BDNF的含量有关.