李廷菊, 樊锦雅, 王成辉, 古 锐, 钟世红

(1.成都中医药大学药学院, 成都 611137; 2.成都中医药大学民族医药学院, 成都 611137; 3.西南民族大学药学院, 成都 610041)

独一味[Lamiophlomisrotata(Benth.) Kudo],又称达巴、嘎果拉、野秦艽, 是唇形科独一味属多年生草本植物,为《中华人民共和国药典》2020年版一部所收载,为常用大宗藏药材,具有活血止血,祛风止痛之功效[1]。目前,以独一味为原料的复方制剂涉及30余种,包括藏药奇正消痛贴、独一味丸、独一味颗粒等。在市场需求日益庞大与野生资源逐渐萎缩的背景下,多地已经开展人工种植探索[2]。独一味主要依靠种子繁殖,但野生种子质量却参差不齐,导致种子萌发实验耗时相对较长,为了快速了解种子质量,开发快速检测方法已成为亟待解决的问题。

种子的生活力是指种子的潜在发芽能力或者种胚所具有的生命力,是种子预期能够长成正常幼苗的潜在能力[3]。四唑染色法测定种子生活力具有简单、方便、快速而准确的优点,现已成为国际通用的种子检测方法[4],但对独一味种子生活力测定的方法优化研究目前尚少见报道,胡莹莹等[5]仅对其生活力进行了初步研究,未摸索其最适染色条件。本研究采用单因素试验和正交试验对测定种子活力的5个相关影响因素进行研究,明确独一味种子生活力检测的最优条件,以期能够快速客观地评价独一味种子的萌发率,完善独一味种子质量检测方法,为无土育苗的种子处理和育苗研究提供参考。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

供试独一味种子于2021年9月初采自四川省阿坝藏族羌族自治州阿坝县分水岭,经成都中医药大学民族医药学院古锐教授鉴定为唇形科植物独一味的种子,用簸箕、撞笼、木棒等工具抖种子,采用水选法除去瘪种子,选取健康饱满、无病虫害、无机械损伤的种子作为供试种子,千粒重为3.070 g,保存于4 ℃冰箱内备用。

1.2 发芽率测定

取独一味种子50粒,重复3次,用流水冲洗干净后,放入0.5%高锰酸钾溶液中消毒30 min,蒸馏水洗净,用100 mg/L赤霉素(GA3)溶液浸泡24 h,然后置于直径为90 mm的培养皿中,内垫2层滤纸,盖上皿盖保湿,25 ℃恒温培养箱萌发。每日记录种子萌发情况及发芽粒数,连续记录直至连续7 d不再发芽为止。

1.3 TTC染色方法

1.3.1仪器和试剂

恒温培养箱,培养皿,手术刀,镊子,2,3,5-氯代三苯基四氮唑,pH=7.0磷酸缓冲液。

1.3.2TTC染色试剂的配制

磷酸缓冲溶液的配制参照雷慧霞等[6]的方法,先配制pH=7.0的磷酸缓冲溶液,再在此基础上配制不同浓度的TTC溶液。

0.1% TTC溶液配制:称取0.1 g 2,3,5-氯代三苯基四氮唑粉剂溶解于100 mL磷酸缓冲溶液,按此法分别配制0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%TTC溶液,于棕色瓶中4 ℃冰箱避光保存备用。

1.3.3种子处理

取浸种后的种子25粒,3次重复,用手术刀划开胚乳,取出发育良好、完整无损伤的胚,置于直径90 mm的培养皿中,倒入配制好的染色液,以浸没为度,在各培养皿上标记所用TTC溶液浓度,置于相应温度的烘箱中暗光进行染色反应。待达到设定的培养时间时,取出培养皿,倒去染色液,用去离子水稍稍冲洗胚,然后将胚放置于滤纸上吸去多余水分,以白色滤纸为背景,根据胚染色深浅和面积大小判断种子活力。

1.3.4最优测定条件试验

1) 单因素试验

浸种温度:采用浸种时间24 h,染色温度25 ℃,染色时间6 h,TTC浓度为0.5%,浸种温度分别设置20、25、30、35、40 ℃对种子进行染色,测定胚活力。

浸种时间:采用浸种温度30 ℃,染色温度25 ℃,染色时间6 h,TTC浓度为0.5%,浸种时间分别设置6、9、12、24、36 h对种子进行染色,测定胚活力。

染色温度:采用浸种温度30 ℃,浸种时间24 h,染色时间6 h,TTC浓度为0.5%,染色温度分别设置20、25、30、35、40 ℃对种子进行染色,测定胚活力。

染色时间:采用浸种温度30 ℃,浸种时间24 h,染色温度25 ℃,TTC浓度为0.5%,染色时间分别设置1、3、6、9、12 h对种子进行染色,测定胚活力。

TTC溶液浓度:采用浸种温度30 ℃,浸种时间24 h,染色温度25 ℃,染色时间6 h,TTC溶液浓度分别为0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%对种子进行染色,测定胚活力。

2) 正交试验

采用L16(45)5因素4水平正交设计(见表1),试验以单因素试验结果为依据,以浸种温度、浸种时间、染色温度、染色时间、TTC浓度等5个主要影响独一味种子染色的因素进行正交试验,每个因素设置4个水平。每组25粒,3次重复。

1.3.5染色后观察

按《国际种子检验规程》判断种子是否有生活力[7]:胚全部或绝大部分染成鲜红色或大红色为有生活力种子,只有少部分胚染色或大部分染色为淡粉色为低活力或无生活力种子。

种子生活力/%=(有生活力的种子数/供试种子总数)×100%。

表1 独一味种子生活力测定正交试验因素和水平Table 1 Determination of orthogonal test factors and levels by Lamiophlomis rotata viability

1.3.6数据分析

采用Excel 2019和SPSS 26.0软件进行数据处理分析,p<0.05表示差异显著,p<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 种子发芽率测定结果

经统计,独一味种子萌发粒数分别为40粒、44粒、46粒,发芽率为86.67%。

2.2 单因素试验结果

单因素试验结果见表2。独一味种子在不同浸种温度下,胚的着色率随浸种温度升高而升高然后下降,在25 ℃时着色率最高,为80.0%,因此最佳浸种温度为25 ℃;不同浸种时间处理时,胚的着色率依次为:浸种9 h>浸种24 h>浸种12 h>浸种6 h,即浸种9 h为最佳浸种时间;不同染色温度处理时,胚的着色率随染色温度升高呈先增后减的趋势,表明染色时染色温度不宜过高,即适宜染色温度为30 ℃(86.0%);不同染色时间处理时,胚的着色率随染色时间的延长而增加,当染色时间达到12 h时,胚的着色率最高(91.7%),因此最佳染色时间在12 h左右;TTC浓度为0.1%、0.3%、0.5%时胚的着色率非常接近,但是当TTC浓度升到1.0%、2.0%时,着色率逐步降低,综合考虑最佳TTC浓度应为0.1%。综上所述,单因素条件下,最佳染色条件为浸种温度25 ℃、浸种时间9 h、染色温度30 ℃、染色时间12 h、TTC浓度0.1%。

表2 种子生活力测定单因素试验结果Table 2 Single factor test results of seed viability determination

2.3 正交试验结果

正交试验结果见表3。在不同因素与水平组合处理下,独一味种子生活力介于59.3%～89.3%之间,存在较大差异,其中以处理组合6(25 ℃浸种9 h、0.1%TTC、40 ℃染色9 h)和处理组合11(30 ℃浸种12 h、0.1% TTC、30 ℃恒温箱染色12 h)染色效果最好,而处理组合1(20 ℃浸种6 h、0.1% TTC、25 ℃染色3 h)的种子生活力最低,染色较浅,效果最差。

2.4 极差分析

对正交试验数据进行极差分析(见表3),比较5个因素对独一味种子胚生活力的影响大小。5个因素的极差值R分别为:R浸种温度=7.97,R浸种时间=8.95,RTTC浓度=10.00,R染色温度=13.68,R染色时间=14.45,即它们对独一味种子胚生活力的影响依次为:染色时间>染色温度>TTC浓度>浸种时间>浸种温度,其中染色时间和染色温度对胚生活力影响最大,浸种温度影响最小。

用各因素对应的极差最大值(Ⅰj、Ⅱj、Ⅲj、Ⅳj)来确定测定种子生活力的最适条件,值越大表示最适程度越高。浸种温度对应的Ⅰ1、Ⅱ1、Ⅲ1、Ⅳ1的值分别为75.08、81.20、73.23、80.13,可以看出Ⅱ2值最大,即25 ℃为最适浸种温度;浸种时间对应的Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅲ2、Ⅳ2值中Ⅲ2最大,即最适浸种时间为12 h;同理可知最适的TTC浓度、染色温度、染色时间依次为0.1% TTC、40 ℃恒温箱染色12 h,无处理组合相对应,与正交实验分析结果进行对比,出于节约时间和成本的考虑,处理组合6较为适宜,可为最佳染色条件。

表3 种子生活力测定正交试验结果Table 3 Orthogonal test results of seed viability determination

2.5 方差分析

方差分析结果见表4。试验设定的5个因素,即浸种温度、浸种时间、染色温度、染色时间、TTC浓度的p值均小于0.01,表明每个因素对种子生活力均有影响。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

3 结论与讨论

TTC染色检测种子生活力对快速检验植物种子的质量具有重要的指导意义[7],因此,国际种子检验规程以及我国农作物种子检验规程均将其作为检测种子生活力及种子活力的重要参考。通过种子发芽率来判断独一味种子的质量过程较长,从置盘至完全发芽需要15 d左右,而TTC染色能快速进行质量检验,大大缩短时间成本。本实验中,处理6和处理11染色效果相近,并与统计分析结果最佳处理方法有部分重合,因此,从节约时间和节约成本的角度考虑[6,8],选择组合6作为最佳染色组合。王改花等[9]用0.09 g/mL+2 mL H2O牛粪水浸液、200 mg/L GA3、0.1%细胞分裂素浓度处理种子,发芽率分别为93.33%、73.33%、86.67%;罗桂花、金兰[10]研究表明,种子千粒重5.03 g、温度25 ℃、50 mg/L GA3浸种24 h,发芽率为90.67%;胡莹莹等[5]研究表明,蒸馏水浸种24 h,发芽率为82.67%;以上实验及本实验测定的发芽率(86.67%)和生活力测定(89.3%)均较为接近,其差异在于萌发实验所用种子饱满度各不相同,部分种子虽果实饱满但胚乳已经霉变,实际操作中不易发现,经激素处理后其发芽率有所增减,故采用TTC法快速测定独一味质量具有一定的指导意义,在育苗实践中可作为参考。

正交试验设计常被广泛应用于种子TTC染色的最佳因素和水平筛选优化上。种子浸泡温度、浸泡时间、TTC浓度、染色温度和染色时间等5个因素均能显著影响独一味种子染色效果,影响依次为:染色时间>染色温度>TTC浓度>浸种时间>浸种温度。其中染色温度和染色时间为首要影响因素,表明这两个因素是决定独一味种子TTC染色效果最关键的因素。这一结果与王志威等[11]、朱思宇等[12]、吴红等[13]对种子的生活力检测结果有相似之处,即染色温度和染色时间对于种子染色更为重要,后续可根据需要优化检测方法。