乐 帅, 郭 瑞, 陈 高, 屈雪华, 陈禅友

(江汉大学生命科学学院/湖北省豆类(蔬菜)植物工程技术研究中心, 武汉 430056)

豌豆(PisumsativumL.)又叫青豆、寒豆、荷兰豆,为豆科、蝶形花亚科、豌豆属一年生或越年生的冷凉性作物[1],根据食用目的可分为粮用豌豆、食用嫩豆粒或食嫩荚的菜用豌豆[2]。豌豆作为主要的豆类作物之一遍布全世界,有着悠久的种植历史,可以作为蔬菜、饲料、甚至是主粮[3-4]。豌豆一般越冬栽培,错开农时,能够提高土地利用率,对土壤要求不高,并且豆科作物的固氮作用能够改善土地营养状况[5-6]。豌豆蛋白质含量高,含有满足人体所需要的所有必需氨基酸、微量矿物质及维生素[7]。

豌豆品种繁多,早期豌豆品种鉴定、种子检验都是使用室内检验和田间检验的方法[8],检验误差大。一般来说,豌豆种子含有20%～25%的蛋白质,40%～50%的淀粉和10%～20%的纤维[9],种子贮藏蛋白一般是在种子发育后期大量合成和积累,根据溶解特性可分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白和碱溶蛋白[10-11]。分子生物学研究表明,品种之间的差异主要取决于遗传物质,蛋白质是基因表达的产物,可作为品种鉴定的依据[12]。种子贮藏蛋白具有遗传稳定性,已被作为遗传标记广泛应用于材料间遗传多样性分析、品种鉴定、遗传资源保存和育种相关的植物驯化、植物改良育种等方面[13]。SDS-PAGE种子蛋白质电泳可以根据蛋白质的种类、结构及大小来对蛋白质组分进行分离并成为一种解决植物分类、进化问题、品种和变种的鉴定、种质特征分析的有效工具[14-16]。

前人相关的研究主要涉及种子蛋白电泳对品种的鉴定[17-18]、遗传多样性的分析[19-20]以及种子萌发过程中蛋白变化[21-22];朱新产和赵文明[23-24]以陕西商县白豌豆为研究对象,采用豌豆开花后的天数来划分种子发育期,利用SDS-PAGE蛋白质电泳来探究种子发育过程中贮藏蛋白的生物合成,发现种子发育过程中贮藏蛋白的积累顺序依次是豌豆球蛋白、豆球蛋白、伴豌豆球蛋白。孙雁等[25]以25个豌豆品种为实验材料,分别提取水溶、盐溶、醇溶、碱溶蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,发现水溶、盐溶、碱溶3种蛋白在品种间存在不同程度的谱带差异,可以用于品种鉴定。郑蕊等[26]利用双向电泳研究了大豆N 2899开花后种子不同发育过程中蛋白质的差异表达,发现有些蛋白质在整个发育过程中都出现,有些蛋白质只出现在发育早期或成熟的种子中,这些蛋白主要参与种子的成熟。耿晓宇等[27]以甘蓝型油菜品种为材料,从开花后固定天数取样测定种子发育的蛋白质含量,发现种子发育过程中的蛋白质积累为较复杂的三峰或四峰曲线,高蛋白质材料在开花后60 d左右蛋白质含量极显著高于低蛋白质材料,且在此时达到最大值。蒋冬花等[28]发现,水稻种子贮藏蛋白中谷蛋白和醇溶蛋白是最主要的蛋白,发现醇溶蛋白与谷蛋白电泳图谱在不同水稻品系间都存在比较明显的差异。

本实验以豌豆的形态学特征进行种子发育阶段划分,对供试豌豆不同种子生长时期的4种可溶性蛋白含量进行测定,挖掘豌豆种子发育过程中各蛋白组分含量变化规律;同时将供试豌豆品种不同时期的蛋白质组分进行SDS-PAGE凝胶电泳,从生成电泳图谱查找特异性条带,找到具有种子特异性的条带所对应的发育时期,探究能否在种子尚未完全成熟的时候判断种子之间的差异,为豌豆种质鉴定提供理论和技术依据。

图1 豌豆豆荚发育进程(WD-021)Fig.1 Developmental process of pea pods (WD-021)

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为湖北省豆类(蔬菜)植物工程技术研究中心提供的8个豌豆品种,于2021年11月1日在武汉豆博士农业科技生态园(湖北省武汉市汉南区湘口镇,113°25′E,30°11′N)按小区进行播种,土壤肥力均衡,采用常规的栽培种植模式,每个品种3次重复。品种相关信息如表1所示。

表1 8个豌豆品种形态学特征Table 1 Morphological characteristics of eight pea cultivars

因不同豌豆品种的成熟期、类型以及对环境表现不同,所以不适合用发育天数对豌豆种子发育期进行划分,而选择豌豆的形态学特征划分种子发育阶段,豆类种子成熟阶段[29]可分为绿熟期、黄熟期、完熟期和枯熟期,本研究进行了相应调整,将豌豆种子发育时期分为幼嫩期、嫩荚期、青熟期、黄熟期、完熟期等5个形态学时期进行研究,以WD-021为例,各阶段形态如图1所示。

1.2 方 法

1.2.1不同溶解性的蛋白质组分提取

根据蛋白质的溶解性质,参考Osboren蛋白分类法[30],利用蒸馏水、稀盐、乙醇和稀碱溶液连续提取豌豆种子中的水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白及碱溶蛋白组分。分别取幼嫩期到完熟期豌豆种子,利用研钵或磨粉机粉碎并装入离心管中超声波清浸提,取出后离心取上清液定容,最终得到的溶液为水溶蛋白提取液;提取过水溶蛋白的沉淀依次加入5% NaCl溶液、75%乙醇、0.1 mol/L NaOH,重复水溶蛋白提取步骤得到盐溶蛋白提取液、醇溶蛋白提取液和碱溶蛋白提取液。

1.2.2蛋白质含量测定

参考考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量[31],以牛血清白蛋白溶液作为测定的蛋白质标样母液,建立回归方程,测定稀释后的蛋白质溶液及母液的吸光度值,以y为吸光度,x为蛋白质含量。用同样的方法测定提取后的豌豆蛋白提取液吸光值,根据回归方程计算出蛋白质含量,结果为每毫克牛血清白蛋白当量每克豌豆样品鲜重。

1.2.3SDS-PAGE蛋白电泳

按照SDS-PAGE法[32]对提取的蛋白进行蛋白电泳,取40 μL蛋白质提取液到1.5 mL离心管,加入10 μL 5×上样缓冲液(1.25 mL Tris-HCl+0.5 g SDS+25 mg溴酚蓝+2.5 mL 50%甘油+250 μL β-巯基乙醇加蒸馏水定容至5 mL)混匀后沸水浴10 min,待冷却后取15 μL点样,Marker点样3 μL,采用12%分离胶,5%浓缩胶;凝胶厚度0.75 mm,调节电压恒定至80 V运行40 min,待Marker跑出条带,溴酚蓝浓缩为一条直线时调节电压120 V运行80 min,直到溴酚蓝指示剂到凝胶底部时停止电泳。取出凝胶放入考马斯亮蓝R-250溶液(2 g考马斯亮蓝 R-250+250 mL异丙醇+100 mL冰醋酸加蒸馏水定容至1 000 mL)中染色40 min,使用脱色液(100 mL冰醋酸+50 mL无水乙醇加蒸馏水定容至1 000 mL)进行脱色,待条带清晰后进行数据读取。

1.2.4数据统计分析

利用WPS软件对蛋白含量的数据进行分类、整合,生成相应图表;利用Quantity one-4.6.2软件对水溶蛋白、盐溶蛋白和碱溶蛋白分离出的电泳谱带进行自动读取,将豌豆种子各蛋白亚基信息以表格的形式呈现。每个材料有对应蛋白分子量的赋值为1,没有的赋值为0,建立0和1的数据矩阵。

2 结果与分析

2.1 蛋白质含量

各品种种子不同发育时期的蛋白质组分含量变化如图2、图3、图4所示。

图2 8个豌豆品种在5个种子发育时期水溶蛋白含量Fig.2 Albumin protein content in eight pea cultivars at five seed developmental stages

图3 8个豌豆品种在5个种子发育时期盐溶蛋白含量Fig.3 Salt-soluble protein content in eight pea cultivars at five seed developmental stages

幼嫩期各蛋白组分的占比差距不大,嫩荚期开始水溶蛋白占大多数,可知水溶蛋白从嫩荚期开始加速积累。在青熟期以前,盐溶蛋白与碱溶蛋白差异不显著,青熟期以后,盐溶蛋白开始加速积累。碱溶蛋白品种间变化的一致性很强,在黄熟期以前一直趋于相对稳定状态,黄熟期以后才开始大量积累并最终超过盐溶蛋白的含量。除醇溶蛋白外,其他3种蛋白质组分含量随着种子的成熟而逐渐增加,并在完熟期达到最大值,完熟期蛋白质组分含量差异最大。不同豌豆品种的蛋白质组分含量差异极显著(p<0.01),种子发育时期各蛋白组分中,WD-021和WD-123总的可溶性蛋白均相对较高。豌豆醇溶蛋白含量如表2所示,除幼嫩期与嫩荚期含量极少外,其余时期几乎检测不到醇溶蛋白,可见醇溶蛋白在种子形成之初就存在,在种子生长发育过程中并未明显增加且在嫩荚期之后消失。

表2 8个豌豆品种在5个种子发育时期醇溶蛋白质组分含量Table 2 Gliadin content in eight pea cultivars at five seed developmental stages

如表3所示,在豌豆种子生长发育过程中,不同蛋白质组分含量均有差异,水溶蛋白含量始终高于其他3种蛋白。

表3 豌豆种子5个发育时期蛋白组分含量方差分析Table 3 Variance analysis of protein fraction contents among five developmental stages at pea seeds

表4 商品荚时期8个品种3种蛋白质组分含量Table 4 Protein fractions contents of three from eight cultivars at the commercial pod stage

菜用豌豆的食用时期主要在商品荚时期,因此商品荚时期豌豆蛋白组分含量对消费者具有一定的营养参考价值。商品荚采收时期对应甜豌豆种子发育的青熟期以及荷兰豆种子发育的嫩荚期,供试材料各蛋白的含量如表4所示,水溶蛋白含量占可溶性蛋白的绝大部分,甜豌豆品种各蛋白组分含量均明显高于荷兰豆品种,WD-021与WD-123的水溶蛋白显著(p<0.05)高于其他豌豆品种,此表可作为不同豌豆品种蛋白质营养成分摄入的参考。

2.2 幼嫩期到黄熟期蛋白凝胶电泳

通常能够进行品种鉴定的蛋白谱带是能够与其他品种谱带进行区分并且稳定遗传的谱带。通过不同豌豆品种幼嫩期及完熟期各蛋白亚基信息,以表格的形式呈现0和1的数据矩阵,对符合条件的蛋白谱带进行查找,WD-001和WD-005在完熟期以前均不能通过电泳谱带进行区分。WD-008黄熟期水溶蛋白的14、24、31号谱带,盐溶蛋白的10、11、16、22、40号谱带,碱溶蛋白的5、9、14、21、30、31、33、40、42号谱带能够将WD-008进行区分。WD-021青熟期水溶蛋白的20、21、27、37、39、40、44号谱带,盐溶蛋白的20、27、30、40号谱带,碱溶蛋白的5、8、9、20、21、28、30、40号谱带能将WD-021进行区分;黄熟期水溶蛋白的9、14、20、31、40号谱带,盐溶蛋白的10、11、16、23、27、40号谱带能将WD-021进行区分。WD-051青熟期盐溶蛋白的30号谱带,碱溶蛋白的33、40、42号谱带能将WD-051进行区分。WD-085青熟期水溶蛋白的27、31、37、44号谱带,盐溶蛋白的20、27、30、40号谱带,碱溶蛋白的5、8、20、21、40号谱带能将WD-085进行区分;黄熟期水溶蛋白的9、10、11、12、31、40号谱带,盐溶蛋白的10、27、34号谱带,碱溶蛋白的5、9、21、27、29、40号谱带能将WD-085进行区分。WD-118青熟期水溶蛋白的20、21、27、33、37、39号谱带,盐溶蛋白20、23、27、30号谱带,碱溶蛋白的5、8、9、14、20、21、22、30、31、37、39、40、42号谱带能将WD-118进行区分;黄熟期水溶蛋白的9、10、11、12、20、22、24、33、40号谱带,盐溶蛋白的10、11、22、23、27、40号谱带,碱溶蛋白的5、9、10、14、22、24、30、31、39、42号谱带能将WD-118进行区分。WD-123黄熟期水溶蛋白的9、11、20、24、31、40号谱带,盐溶蛋白的10、23、40号谱带,碱溶蛋白的5、9、24、30、33、39、42号谱带能将WD-123进行区分。所有品种均无法在幼嫩期和嫩荚期进行区分,因此该时期的种子蛋白仅具备营养特性;青熟期和黄熟期部分品种能够通过电泳谱带进行区分,所以该时期是种子蛋白从营养属性开始转变为兼备种质特异性的过渡期,但还达不到区分所有豌豆品种的条件。如图5所示,以WD-008为例在不同时期不同组分的蛋白电泳,也可以看出3种蛋白在幼嫩期和嫩荚期的电泳谱带比较离散不清晰,青熟期之后蛋白条带相对清晰并且谱带变化波动较小。

注:以WD-008为例从左到右依次为水溶蛋白、盐溶蛋白、碱溶蛋白;M为蛋白质Marker,含有10条谱带,相对分子量分别为180 kDa、130 kDa、95 kDa、70 kDa、55 kDa、43 kDa、33 kDa、25 kDa、17 kDa、10 kDa;A～E依次为幼嫩期、嫩荚期、青熟期、黄熟期、完熟期。图5 豌豆种子5个发育时期3种蛋白组分电泳图(WD-008)Fig.5 Electrophoretic diagram of three proteins at five seed developmental stages (WD-008)

2.3 完熟期蛋白凝胶电泳

豌豆种子完熟期水溶蛋白分离的各亚基凝胶电泳如图6所示,其相对分子量在10.62～95.55 kDa之间,主要分布区间在66.53～95.55 kDa、24.11～51.56 kDa以及13.13～19.17 kDa。完熟期种子水溶蛋白总共有31条谱带,WD-118谱带数量最多为27条,WD-008分离出的谱带数量最少为20条。其中谱带1、4、5、9、10、14、16、17、18、20、21、25、28号在8个豌豆种子材料中都有出现,为保守条带,共14条,比率为45.16%。

豌豆种子完熟期盐溶蛋白分离的各亚基凝胶电泳如图7所示,其相对分子量在16.78～95.55 kDa之间,主要分布在21.92～49.84 kDa和16.78～19.72 kDa范围中,总共有24条谱带,WD-005与WD-008有24条谱带数量最多,WD-001的谱带条数为17,数量最少。其中谱带2、3、4、6、9、11、12、14、16、18、19、20、21、24、25号在8个豌豆种子材料中都有出现,共15条保守带,保守条带所占比率为62.50%,由此可见和水溶蛋白相比,盐溶蛋白的保守性更强。

豌豆种子完熟期碱溶蛋白分离的各亚基凝胶电泳如图8所示,其各亚基相对分子量在15.69～95.55 kDa之间,主要分布在73.58～95.55 kDa、22.36～49.84 kDa以及15.69～19.12 kDa区域,共有28条谱带,WD-118谱带数量最多,为26条,WD-001的谱带数量最少,为16条,其中2、8、9、12、14、15、19、20、21、26、27、28号谱带在供试材料中均有出现,为保守带,共12条,其保守带所占比率为42.86%。

注:M为蛋白质Marker,含有10条谱带,相对分子量分别为180 kDa、130 kDa、95 kDa、70 kDa、55 kDa、43 kDa、33 kDa、25 kDa、17 kDa、10 kDa;1～8分别对应8个豌豆品种,依次为WD-001、WD-005、WD-008、WD-021、WD-051、WD-085、WD-118、WD-123。下同。图6 8个豌豆品种种子完熟期水溶蛋白电泳图Fig.6 Electrophoretic diagram of album at the full ripen stage of seed in eight pea cultivars

图7 8个豌豆品种种子完熟期盐溶蛋白电泳图Fig.7 Electrophoretic diagram of salt-soluble protein at the full ripen stage of seed in eight pea cultivars

图8 8个豌豆品种种子完熟期碱溶蛋白电泳图Fig.8 Electrophoretic diagram of alkali-soluble protein at the full ripen stage of seed in eight pea cultivars

根据完熟期不同蛋白组分的电泳谱带可以得出盐溶蛋白的保守性最强,其次是水溶蛋白,最后是碱溶蛋白。完熟期各豌豆品种均能结合水溶蛋白6、7、10、11、12、13、20、21、22、24、33、34、41、43、45号谱带,盐溶蛋白5、11、13、14、16、22、24、27、38、39号谱带,碱溶蛋白5、6、9、10、12、14、21、22、34、28、29、30、36、39号谱带进行品种区分。其中具备代表性的谱带有水溶蛋白中7号谱带是WD-051的特有带,如图6的5号泳道箭头所示;29、45号谱带是WD-008的特有带,如图6的3号泳道箭头所示;盐溶蛋白中13号谱带是WD-051的特有带,如图7的5号泳道箭头所示。盐溶蛋白中的5号谱带只有WD-001没有,如图7方框所示;碱溶蛋白中5、30号谱带只有WD-001没有,图8的方框所示。在完熟期中各蛋白组分已经积累至相对稳定状态,并且可以通过电泳谱带进行品种区分,因此豌豆种子生长发育阶段到完熟期具备种质特异性。

3 讨 论

3.1 种子蛋白质变化的时序性

豌豆种子蛋白的发育是一个动态变化的过程,尽管在豌豆种子发育时期不同豌豆品种的蛋白组分含量有差异,但是在变化趋势上是一致的,到完熟期达到最大值;完熟期种子各蛋白组分含量由多到少依次为水溶蛋白、碱溶蛋白、盐溶蛋白,这与刘珍珍[33]研究蚕豆清蛋白和谷蛋白是相对含量最多的组分的结果相同。水溶、盐溶、碱溶蛋白分别在嫩荚期、青熟期、黄熟期之后开始加速积累直至完熟期,可以看出这三种蛋白才是主要的豌豆种子贮藏蛋白,而醇溶蛋白在种子发育早期含量极少并在后期消失,这一结果与孙雁等[25]的研究结果有相似之处。从醇溶蛋白变化规律推出醇溶蛋白是仅供植物生长发育前期所需要的成分,而在生长发育后期不需要,因而就没有醇溶蛋白的表达,也说明醇溶蛋白既不是为人类提供的营养物质更不是贮藏蛋白的组成部分。在商品荚时期,甜豌豆品种可溶性蛋白含量显著高于荷兰豆品种,且甜豌豆品种WD-021和WD-123显著高于其他品种,因此有利于通过这两个品种的栽培来获取优质蛋白营养。

3.2 蛋白质电泳图谱信息及其利用

对豌豆种子不同生长发育时期蛋白电泳条带比较分析可知,幼嫩期到嫩荚期豌豆种子蛋白电泳谱带具有同质性。青熟期和黄熟期只有部分品种间具有差异,说明该时期是种子蛋白从营养属性转变为兼备种质特异性的重要转换期且以营养属性为主。在探究种子未完全成熟时判断种子之间的差异问题上,虽然不能够准确地进行品种区分判断,但是在接近完熟期时的蛋白电泳图谱能够提供一些信息依据。在完熟期豌豆蛋白积累相对稳定,并且能够结合3种蛋白组分信息区分不同品种,完熟期的种子蛋白兼具营养和遗传的双重特性。完熟期各蛋白组分的保守性强弱依次为盐溶蛋白、水溶蛋白、碱溶蛋白,因此通过以上结果可以优先用完熟期碱溶蛋白和水溶蛋白的电泳谱带对品种进行区分。随着豌豆种子的发育蛋白谱带的不断变化,生长早期分布的有些谱带在后期消失,同时也伴随着一些谱带的生成,直至完熟期电泳谱带趋于稳定,说明早期的种子蛋白优先满足生长发育的需要,后期由于基因的调控生成一些有别于其他品种的特异性谱带,具备种质特异性。