侯文川, 杨林林, 初雷霞, 董 宁, 杜真辉, 钟 华, 董诚明

(1.河南中医药大学药学院, 郑州 450046;2.河南省道地药材生态种植工程技术研究中心, 郑州 450046;3.河南省平舆县农业农村局, 河南 平舆 463400)

箭叶淫羊藿[Epimediumsagittatum(Sieb. et Zucc.)Maxim.]是小檗科淫羊藿属多年生草本植物,主要分布于湖南、安徽、河南等省,以叶入药,为我国传统中药材淫羊藿的基原之一[1]。淫羊藿具有抗炎、抗肿瘤、抗骨质疏松等多种药理作用[2],在医药、保健等领域应用广泛[3],是最具开发潜力和市场潜力的中药之一。随着市场需求量的不断增大,箭叶淫羊藿人工栽培面积逐年攀升。目前在河南省豫南地区已经形成较大规模人工种植基地,其中驻马店市种植面积为266.67 hm2,年产量在400 t以上。

种子是中药材生产的源头,优良的种子是生产优质高产中药材的先决条件[4],开展种子质量检验研究不仅是保证中药材质量安全稳定的前提,更是规范化生产急需解决的重要问题[5-7]。箭叶淫羊藿繁殖方式主要包括根茎分蘖和种子繁殖[8]。因箭叶淫羊藿种子结实率低,具有休眠特性[9],所以实际生产多以根茎分蘖为主,但长期的无性繁殖会导致种性退化,病虫害频发,因此种子繁殖技术研究迫在眉睫。研究表明淫羊藿属植物种子普遍存在休眠现象,究其原因是胚形态后熟和发芽抑制物的存在,而低温和激素处理能促进胚成熟、解除休眠、加快萌发[10-12]。目前关于箭叶淫羊藿种子研究主要集中在促进萌发和提高结实率等方面,尚未见到箭叶淫羊藿种子质量检验方法的研究。

本试验参考农作物种子质量检验规程,从含水量、生活力、发芽率等方面进行种子质量检验方法研究,为箭叶淫羊藿种子质量标准的制定提供依据,为扩大种植生产和提高种子的流通奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为河南省驻马店市平舆县箭叶淫羊藿规范化种植基地提供的当年种子,经河南中医药大学董诚明教授鉴定为箭叶淫羊藿(Epimediumsagittatum(Sieb. et Zucc.)Maxim.)种子。

1.2 仪器和试剂

RTOP-430 D智能人工气候培养箱(浙江托普仪器有限公司);SMZ-171体视显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司);LDZM-80 KCS型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。

红四氮唑(分析纯)(上海山浦化工有限公司);赤霉素(国药集团化学试剂有限公司);脱落酸(北京索莱宝科技有限公司);白菜种子(临朐县天和种业有限公司)。

2 方 法

2.1 种子真实性鉴定

随机数取种子100粒,重复3次,逐一观察种子的形状、颜色、表面构造等特征,测量横径与纵径,并纵剖成熟种子观察、记录,计算胚率。

2.2 千粒重测定

分别用百粒法、五百粒法及千粒法测定,具体操作如下:随机取100、500、1 000粒净种子,称重,并分别重复8、6、3次,记录重量。计算均值、标准差及变异系数。

2.3 含水量测定

随机取2份种子,每份2.5 g,分别用低恒温法[(105±2)℃]和高恒温法[(130±2)℃]测定含水量。分别于1、2、3、4、5、6、7、8、16 h和1、2、3、4、5、6 h计算种子水分损失量,重复3次。

2.4 种皮透水性测定

随机取100粒种子,称定重量。置于蒸馏水中在25 ℃恒温条件下,每隔1 h取出,用吸水纸吸干表面水分后,称重,直至连续2次测定值接近恒重为止。重复3次,计算吸水率并绘制吸水曲线。

吸水率/%=[(W1-W)/W]×100%,式中,W1为吸水后重量,W为吸水前重量。

2.5 生活力测定

采用TTC染色法,用pH值为6.5～7.5的缓冲液分别配置质量分数为0.1%、0.5%、1.0%、1.5%的TTC溶液,避光保存。种子在蒸馏水中浸泡8 h后沿种胚纵切,暴露胚,于25 ℃下分别染色1、2、3、4 h后,冲洗3～5次,观察、记录种子染色情况,计算生活率。重复3次,每次取种子100粒。

2.6 种子发芽最适条件

2.6.1适宜的发芽床

种子经75%酒精消毒2 min后,分别置于高温灭菌过的沙床、纸床、脱脂棉3种发芽床上。在温度设定为15 ℃培养90 d后转至4 ℃的培养箱中发芽,每隔20 d观察记录种子霉变情况。3次重复,每次100粒种子。

2.6.2适宜的种子破眠温度

取1 000粒种子拌于沙床中,置于4 ℃、15 ℃、25 ℃黑暗恒温下进行试验。每隔7 d搅拌翻动以保持通风并及时补充水分。每隔20 d,随机抽取15粒种子,于体视解剖镜下观察不同层积阶段种胚生长发育状况,测定胚长、胚乳长,并计算胚率,3次重复。

胚率/%=(胚长/胚乳长)×100%。

2.6.3适宜的种子破眠激素处理

选择外源激素赤霉素(GA3)和脱落酸(ABA),分别设置不同浓度:

GA3:100 mg/L、200 mg/L;

ABA:50 mg/L、100 mg/L。

图1 箭叶淫羊藿种子表面构造Fig.1 Surface structure of E. sagittatum seeds

种子处理方式为浸泡8 h和种胚达到鱼雷期后,以喷施形式保湿两种。设计以蒸馏水处理为空白对照的9个处理组(表1),筛选最适破眠激素处理。

表1 种子破眠激素试验设计Table 1 Seed sleep hormone trial design

2.6.4发芽实验

破眠处理后种子出现出芽时,即可进行发芽实验。在15 ℃恒温光照培养箱中进行,光照12 h/d,每处理设3个重复,每个重复150粒种子,以伸出子叶为发芽标准,于第16天测定其发芽率。

3 结 果

3.1 种子基本形态

箭叶淫羊藿种子为肾状长圆形,饱满,外种皮呈现黑色有褶皱纹理,内种皮呈现红褐色光亮不皱缩或皱缩,种脐明显,种孔与种脐位于同一部位,形成倒生胚珠,具有瘤状突起的种阜;种子的外部形态变化不大,经测定,箭叶淫羊藿种子横径为(1.643±0.169)mm,纵径为(4.728±0.388)mm(图1);种子成熟时,其胚率较低,为2.63%,存在明显的形态休眠。

3.2 千粒重测定

由表2可知,3种方法变异系数均小于4.0%。将百粒法与五百粒法测定的种子重量换算为千粒重,结果分别为:(3.080 3±0.040 8)g、(3.036 6±0.096 9)g、(3.062 8±0.042 1)g。进行方差分析,3种方法不存在显著差异,故可用百粒法测定千粒重。

表2 箭叶淫羊藿种子重量测定Table 2 Determination results of seed weight of E. sagittatum

3.3 含水量测定

箭叶淫羊藿种子含水量测定结果见表3,使用高恒温法(130±2)℃和低恒温法(105±2)℃烘干1 h后,水分含量无显著变化。但高恒温法所测得含水量较高,为31.07%,且连续5 h无变化,因此选择高恒温法(130±2)℃烘干1 h检测箭叶淫羊藿种子含水量。

表3 低温法、高温法测定箭叶淫羊藿种子含水量Table 3 Water content determination of E. sagittatum seeds by low temperature method and high temperature method

3.4 种皮透水性测定

箭叶淫羊藿种子最终吸水率为58.52%。吸水过程可分为3个时期:快速吸水期(0～1 h)、缓慢吸水期(1～8 h)和近饱和期(8～10 h)(见图2)。种子吸水结束后,种皮的颜色加深,种皮吸水而软化。

表4 TTC法测定箭叶淫羊藿种子活力Table 4 Seed vigor of E. sagittatum determined by TTC method

3.5 生活力测定

由表4可知,染色1 h,各处理染色情况无显著差异,表现为不能染色;0.1%的TTC溶液染色2 h、3 h、4 h,染色率显著低于其他处理;染色2 h时0.5%、1.0%或1.5%浓度的TTC溶液染色情况无显著差异,且染色均匀,染色效果好。考虑TTC溶液的毒性,箭叶淫羊藿种子生活力测定采用0.5%TTC溶液染色2 h即可(判定标准:有生活力的种子——胚和胚乳完全染色或胚完全染色,胚乳一半以上染色;无生活力的种子——胚未染色,胚乳染色或未染色;胚染色,胚乳一半或一半以上未染色)。

图2 箭叶淫羊藿种子吸水曲线Fig. 2 Water absorption curve of E. sagittatum seeds

3.6 种子发芽最适条件

3.6.1适宜的发芽床

纸床,脱脂棉的发芽床上霉变种子从第9天开始出现并增多,在第60天霉变率达90%以上;而沙床的种子偶见霉变,因此以沙床进行种子处理实验。

3.6.2适宜的温度处理

由图3可见,在恒温处理140 d内,25 ℃处理下种子胚率显著低于15 ℃及4 ℃处理;15 ℃处理下种子的胚率逐渐上升,20～40 d种子胚率上升较快,在80 d之前,胚率一直显著高于其他处理;4 ℃处理下,种子在40 d后胚率快速增长,在140 d时胚率达到66.18%,发芽盒内种子已出芽。在140 d时对4 ℃处理种子进行发芽实验,第16天其发芽率达到46.67%。

图3 不同温度恒温处理下胚率变化Fig.3 Changes of embryo rate under different temperature and constant temperature treatment

3.6.3适宜的激素处理和发芽率

不同激素处理对箭叶淫羊藿种子破眠影响不同。在层积时间为80 d时,处理5、处理6、处理7发芽,且胚率最高,分别为70.69%、69.25%、79.34%,此时处理1(对照组)的胚率为53.88%。而处理8、处理9在层积100 d时发芽,处理1～处理4均在120 d发芽。

对发芽的处理组进行发芽试验,统计发芽率。对9组处理按照综合加权评分法进行计算,综合评价。对层积时长及发芽率分别赋予0.5的权重系数,公式如下:

OD=(0.5×amax/ai+0.5×bi/bmax)×100,式中i指第i个实验处理;max指该指标项下最大值。结果见表5。

由表5可以看出,处理7的OD值为1.22,综合得分最高,层积时间为80 d,发芽率最高。因此箭叶淫羊藿种子发芽试验的最适处理为:种子在蒸馏水中浸泡8 h,置沙床于4 ℃黑暗培养至鱼雷期后,喷施200 mg/L GA3保湿。此处理80 d后种子出现发芽现象,96 d后发芽率为82.67%。

表5 综合评价结果Table 5 Comprehensive evaluation results

4 讨 论

种子作为基本生产资料,是中药材安全生产的基础。优质种子对中药材提高产量、稳定质量起关键作用[13]。随着种植规模的扩大,中药材种子产业市场发展迅速,目前三七[14]、人参[15]等种子已发布国际标准,这对中药材种子规范起到了引领作用,但与农作物种子标准化进程相比,中药材种子质量标准控制还相对落后。箭叶淫羊藿与其他4种入药典淫羊藿属药用植物,在湖北、河南等地已经形成较大规模种植基地,但尚未见过其种子质量检验方法的相关报道,这与其种子萌发困难、休眠特性及繁育周期长等特点有很大关系。

本研究发现,箭叶淫羊藿种子自然成熟时种胚尚未完全发育成熟,胚率较低,有明显的形态生理休眠,这与田向荣等[9]的研究结果一致。除此之外,笔者对其种子内抑制物进行检测发现,箭叶淫羊藿种子水提物及醇提物对白菜种子发芽率及根长均有抑制作用,且抑制作用随浓度增加而增强,说明箭叶淫羊藿种子[9]与巫山淫羊藿[10-11]、朝鲜淫羊藿[12]种子相似,内含萌发抑制物。

种子的萌发和休眠是植物生命周期中具有重要农艺和生态意义的关键组成部分[16]。温度是种子在发育过程中影响萌发的最重要因素[17],水分吸收是启动种子萌发的关键触发因素[18]。ABA和GA3是两种主要的拮抗植物激素,两种激素的合成和分解动态平衡是促进种子萌发和休眠平衡的关键,决定种子的萌发能力[19-20]。本试验结果表明,4 ℃低温层积和GA3激素处理种子,可将种子发芽时间缩短至80 d左右,96 d后发芽率为82.67%。

在种子检验的各项指标中,发芽率最为重要,可直接反映种子出苗率;千粒重和生活力可以间接反映种子的萌发潜力;种皮透水性直接反映种子是否存在种皮吸水障碍,含水量与千粒重、发芽率等密切相关。本研究设置以上指标,旨在对箭叶淫羊藿种子进行科学合理的检验,为淫羊藿属药用植物种子质量标准的制定提供方法和参考,为提高种子繁育专业化水平奠定基础。