陈宇娇, 王满莲, 唐 辉, 李 虹, 张秀姣, 刘宝玉, 郝 敏

(1.桂林理工大学, 广西 桂林 541006; 2.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所, 广西 桂林 541006;3.广西植物功能物质与资源持续利用重点实验室, 广西 桂林 541006)

丽萼熊巴掌(PhyllagathislongiradiosaC. Chen var.pulchellaC. Chen)为野牡丹科(Melastomataceae)锦香草属(Phyllagathis)多年生草本植物,属大叶熊巴掌(P.longiradiosa)的一个变种,常生于海拔200～900 m的石灰岩阔叶林下或荫湿处,属广西特有植物,喀斯特专性植物,局限分布在广西壮族自治区崇左市的马山县、龙州县、大新县[1-2],该物种是广西传统壮药,壮名果妈那产,全株入药,具有清热利湿、活血调经等功效[3],植株株型紧凑,叶色常年为绿色或淡紫色,叶背紫红色,花色鲜艳,花期早于同科植物,具有极高的园林开发潜力,可驯化后用作地被或室内观赏植物。课题组在桂林植物园对丽萼熊巴掌进行了多年的引种驯化,发现丽萼熊巴掌在桂林生长良好,花期集中,花量大,群体花期1月左右,观赏性很强,但其落花落果严重,结实极少甚至不结实,极大限制了对该种的研究和开发利用。

植物繁育系统是包括花部特征、开花、传粉、受精、种子发育、花器官各部位寿命、传粉者种类和频率、自交亲和程度以及交配系统等有性特征总和[4]。系统研究植物的开花物候和繁育系统有利于了解限制其繁育过程的影响因子,从而通过人为干预,促进生物多样性保护。目前,已有对同科的细叶野牡丹(MelastomaintermediumDunn)[5]、毛菍(MelastomasanguineumSims)[6]、枝毛野牡丹(Melastomadendrisetosum)[7]、白花野牡丹(Melastomacandidumf.albiflorumJ. C. Ou)[8]等繁育系统的研究,但尚未见有关丽萼熊巴掌繁育系统的研究报道。本研究以丽萼熊巴掌引种居群为试验对象,观测其花部形态、花期物候、花粉活力,柱头可授性等特征,并结合套袋实验,探究其繁育系统类型及结实率较低的限制因素,为该种的种质资源保育和杂交育种研究提供基础材料,便于今后对丽萼熊巴掌进行药用开发和园林应用研究,丰富广西药用植物景观资源种类,建立广西特色乡土植物景观。

1 材料与方法

1.1 试验材料及研究地概况

2012 年将采自广西壮族自治区左崇市马山县石山的丽萼熊巴掌,扦插繁殖后,2013年露地栽培于广西植物研究所内(110°18′ E、25°4′ N,海拔162 m),现已形成人工种群。试验地属亚热带季风气候,气候温和、雨量充沛、光照充足、四季分明,无霜期316 d,年均温19.1 ℃,年有效积温6.34 ℃,雨水集中于夏季,秋季干旱多风,年均降雨量1 750 mm。

1.2 研究方法

1.2.1花期物候观察

2022年的3月随机选取50株丽萼熊巴掌,记录始花期(植株花朵开放约5%的日期)、盛花期(植株花朵开放约50%的日期)及末花期(植株约95%花朵凋谢的日期);并对单株始花日(第一朵花开放的日期)、终花日(最后一朵花开放的日期)、单花序始花日、终花日、每日开花数、开花高峰期进行观察记录[9]。

1.2.2花部形态观测

随机选取50株丽萼熊巴掌,从中标记100朵单花,每天观察记录单花花部形态变化,包括花瓣、雌雄蕊空间位置的变化、柱头颜色变化直至凋谢[9]。随机选取20朵已经完全盛开的花朵,用游标卡尺测量花冠直径、雌蕊长度、花丝长度、雄蕊药粉囊长度、萼筒长度、花梗长,记录雄蕊数、花萼颜色、花瓣数量、柱头颜色。随机选取50个花序统计单花序花蕾数[7]。

1.2.3花蜜分泌状况检测

随机选取20朵即将开放的花朵用细眼网纱袋套袋。花开后在07:00—17:00时之间,每隔2 h用10 μL微吸管检测是否分泌花蜜[8]。

1.2.4杂交指数的估算

随机选取20朵花,测量记录花朵直径、柱头和花药的空间位置、花药开裂与柱头可授性的时间间隔。依据Dafni[10]的标准估算杂交指数值。

1.2.5花粉-胚珠比测定

随机摘取即将开放的花蕾带回实验室,选取3朵花各取1枚花药,细心解剖,将花粉全部移至刻度试管中,用蒸馏水定容至1.5 mL。在振荡机内充分摇匀后,用移液枪吸取0.1 μL的花粉悬液于血球计数板上,在显微镜下观察并统计花粉数,每个重复3次,计算单花药平均花粉数,乘以花药数即为单花花粉数。随机选取10朵花的子房进行解剖,于体视显微镜下观察统计单花胚珠数[5]。

花粉胚珠比=单花花粉总量/单花胚珠数。

1.2.6花粉粒、柱头形态结构观察

摘取完全盛开的花朵,用镊子夹取雄蕊,弹花粉至载玻片上,在显微镜下观察花粉粒形态。随机选取100个花粉粒,测量极轴和赤道轴,计算平均值与两者比值(P/E)。在体视显微镜下观察柱头形态并拍照。

表1 丽萼熊巴掌种群开花进程Table 1 Flowering process of P. longiradiosa var. pulchella population

1.2.7花粉活力与柱头可授性

晴天随机采集松蕾期(柱头刚冒出,花瓣还未伸展开)、盛花期(柱头完全冒出,花瓣完全展开)、末花期(柱头完全冒出,花瓣合拢)以及谢花期(花瓣及雄蕊脱落,仅余柱头)的花朵,带回实验室。盛花期和末花期的花粉活性测定用I2-KI法、MTT染色法和TTC法[9],5次重复。用联苯胺-过氧化氢法测定柱头可授性。将不同花期的花朵柱头切下,浸入联苯胺反应液(V1%联苯胺∶V3%过氧化氢∶V蒸馏水=4∶11∶22),若柱头处有大量气泡出现,则证明柱头具可授性,5次重复。

1.2.8套袋实验

参照林秋金等[5]的方法进行以下6种处理:

1) 对照,不做任何处理,检测自然条件下的传粉情况;

2) 不去雄、不授粉,在柱头伸出前进行套袋(硫酸纸,下同),检测是否存在主动自交;

3) 不去雄,人工自花授粉后套袋,检测是否自交亲和;

4) 去雄,不同植株异花授粉后套袋,检测杂交是否亲和;

5) 去雄,套40目尼龙网纱袋,检测其结实率是否受传粉者限制;

6) 去雄,套袋,检测是否存在无融合生殖。

1.3 数据分析

使用Excel软件对试验数据进行处理和统计分析。结果以平均值±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 花部形态与开花习性

通过花期物候观察,丽萼熊巴掌的花期为4月中旬至5月中旬。3月下旬花芽开始萌动,4月中旬开花,4月下旬到达盛花期,5月中旬为末花期(表1)。在实际观察过程中,发现丽萼熊巴掌的开花进程受光照影响较大,向阳区域的植株花期普遍较背阴区域植株花期提早2～4 d。

丽萼熊巴掌伞形花序顶生,花冠紫色,广卵形,具缘毛。单花直径(2.182±0.161)cm,雌蕊长(1.369±0.091)cm,花瓣数多为四、稀三瓣或五瓣;雄蕊数与花瓣数对应,多为八、稀六或十;花丝白色,长(0.709±0.079)cm;花药紫红色,长(0.807±0.059)cm,柱头淡粉色或淡紫色;花萼紫红色或透明,萼筒长(0.685±0.059)cm;花梗紫红色,长(1.009±0.145)cm。叶片纸质或近膜质,基部心形。叶片广卵形或近椭圆形,具疏缘毛。叶背常紫红色,叶柄具槽,槽两侧被微柔毛。单株具(5±2)个花序,单花序(25±9)朵花。单花序花期持续(18.6±3.1)d,单花花期1～2 d。

根据丽萼熊巴掌花的发育进程,将花期分为以下5个时期:

1) 花蕾期(图1 A):花被苞片覆盖,花被片突破苞片显露紫红色,萼片绿色,尖端呈紫红色,花萼白色或紫红色,该时期持续17～25 d;

2) 松蕾期(图1 B、C):柱头已经从即将开放的花朵中伸出,分泌少许粘液,花瓣折叠,按逆时针方向排列,花内雄蕊弯折,这一时期持续2～3 d;

3) 盛花期(图1 D、E):花朵完全盛放,花瓣紫色,雄蕊呈环形空间排列,雌蕊位置保持松蕾期伸出位置不变,花药开裂,盛开时间1～2 d;

4) 末花期(图1 F、G):花瓣开始闭合,雌蕊位置不变,雄蕊往中间聚合,雄蕊顶部花药呈褐色,这一时期持续1～2 d;

5) 谢花期(图1 H):花瓣开始萎蔫,随后花瓣和雄蕊开始依次凋落,仅雌蕊宿存,雌蕊柱头由淡粉色变为褐色,宿存1～3 d后也开始凋落。

注:A为花蕾期;B,C为松蕾期;D,E为盛花期;F,G为末花期;H为谢花期。箭头指示为柱头。图1 丽萼熊巴掌花的开放进程Fig.1 Flowering process of P. longiradiosa var. pulchella

通过花蜜检测结果发现,丽萼熊巴掌的花不分泌花蜜。

2.2 杂交指数

丽萼熊巴掌花直径(2.182±0.161)cm,花两性,雌蕊比雄蕊先熟,柱头与花药空间分离。根据Dafnia[10]提出的标准,丽萼熊巴掌杂交指数值为4(表2),该物种的繁育系统为异交,部分自交亲和且需要传粉者。

表2 丽萼熊巴掌杂交指数测定Table 2 Determination for out-crossing index of P. longiradiosa var. pulchella

2.3 花粉胚珠比

丽萼熊巴掌花具雄蕊8个,单花药平均含花粉(177 778±11 111)粒,单花平均花粉粒数(1 422 222±88 889)粒,单花胚珠数平均为(294±45)个,花粉胚珠比值为4 977±895,依据Cruden[11]提出的标准,丽萼熊巴掌的繁育系统属于专性异交(表3)。

表3 丽萼熊巴掌花粉胚珠比Table 3 Pollen-ovule ratios of P. longiradiosa var. pulchella

2.4 花粉与柱头的生物学特性

2.4.1柱头形态结构与柱头可授性

丽萼熊巴掌花柱长(1.36±0.09)cm,柱头顶端呈圆形,淡粉色至淡紫色,直径约0.3 mm,柱头花粉接受面密布透明状乳突,表面分泌粘液(图2),这样的结构能使它更容易接受花粉。松蕾期柱头乳突不明显,而盛花期、末花期和谢花期柱头均能看到较为明显乳突,末花期和谢花期柱头有明显褐色且谢花期柱头褐色较深(图2 C、D),将4个时期的柱头浸泡至联苯胺-过氧化氢溶液中,柱头周围均有气泡产生(图3)。其中,松蕾期柱头产生的气泡较少,其余3个时期均产生大量气泡,说明4个时期的柱头都具有授粉活性,松蕾期柱头授粉活性最低,盛花期授粉活性最高。

注:A为松蕾期;B为盛花期;C为末花期;D为谢花期。下同。图2 丽萼熊巴掌4个时期柱头形态对比Fig.2 Comparison for stigma morphology of P. longiradiosa var. pulchella in four periods

2.4.2花粉形态结构与花粉活力

丽萼熊巴掌花粉呈椭圆形或卵圆形,花粉粒大小(16.99±1.46)μm×(17.95±1.27)μm,P/E比值为1.06±0.06。通过3种染色法(I2-KI、MTT、TTC)检测盛花期、末花期的花粉活性,发现花粉对MTT染色法反应明显,有活力的花粉明显变为蓝紫色。其余2种染色法反应不明显,应用I2-KI染色法所有花粉均被染为黄褐色,无法判断花粉活性。使用TTC染色法的花粉几乎不上色,难以分辨花粉活力。综上,最终选择MTT染色法测定丽萼熊巴掌的花粉活力。

图3 丽萼熊巴掌的柱头可授性Fig.3 Stigma receptivity of P. longiradiosa var. pulchella

各时期取5个样本,统计其花粉活力。由图4可知,盛花期花粉活力均高于95%,平均为(95.97±0.56)%,末花期平均花粉活力(60.85±3.51)%,花粉活性最低为58%。盛花期大多数花粉被染成深紫色,

图4 盛花期与末花期花粉活力对比Fig.4 Comparison of pollen activity between flowering and terminal stage

少数为淡紫色,极少部分不染色(图5 A),末花期花粉大部分被染成淡紫色或不染色,少部分为深紫色(图5 B),说明末花期花粉仍具有活力,只是相较于盛花期花粉活性较低。

2.5 套袋实验结果

由表4可知,丽萼熊巴掌人工异花授粉的坐果率为30%,高于人工自花授粉的坐果率(8%),说明该物种具有较强的异花传粉倾向,同时证明其繁育系统主要为异交型,存在部分自交亲和。直接套袋处理不结实,说明丽萼熊巴掌的自然自交需要传粉者,不存在主动自交现象。去雄直接套袋的坐果率为0,表明丽萼熊巴掌不存在无融合生殖。在自然授粉条件下,丽萼熊巴掌坐果率为12%,低于人工异花授粉坐果率,说明丽萼熊巴掌传粉活动受传粉者限制;去雄直接套网纱袋坐果率仅2%,表明其存在风媒传粉现象,但主要自然传粉方式还是通过昆虫访花。

表4 丽萼熊巴掌套袋实验结果Table 4 The test result of emasculation of P. longiradiosa var. pulchella

3 讨 论

3.1 丽萼熊巴掌的开花动态及花部形态

花作为被子植物的繁殖器官,为保证其物种的繁殖与延续,会根据环境变化形成多样的花部活动[12]。丽萼熊巴掌柱头成熟与花药开裂时间存在差异,柱头成熟在前,花药开裂在后,这样的选择既能有效避免自

花传粉,又能提高其传粉的准确性,延长异花授粉时间。丽萼熊巴掌松蕾期(图1 B、C)柱头从花朵中伸出,分泌少许粘液,花瓣折叠,按逆时针方向排列,花内雄蕊弯折,2～3 d后达到盛花期(图1 D、E),此时花瓣完全展开,雄蕊呈环形空间排列,雌蕊位置保持松蕾期伸出位置不变,花药开裂,持续1～2 d后到达末花期(图1 F、G),此时花瓣开始闭合,雌蕊位置不变,雄蕊往中间聚合,这一时期持续1～2 d,这表明其花部器官在空间上呈现动态式雌雄异位[13-14],两者结合为异花授粉提供了可能。柱头主要分为可产生溢出物黏着花粉的湿型柱头和不产生溢出物的干型柱头[15-16]。通过观察可知丽萼熊巴掌为湿型柱头,柱头表面有许多带粘液乳突,可有效黏着花粉,并且丽萼熊巴掌直至开花末期,柱头仍具有可授性,而同科植物枝毛野牡丹、毛菍的柱头在花后才具有活性[6-7],多样的传粉机制和较长的传粉时间可为丽萼熊巴掌繁殖提供多种保障措施。

值得注意的是检测丽萼熊巴掌花粉活力时,使用I2-KI法所有花粉均被染为黄褐色,使用TTC法花粉几乎不上色,均不能判断花粉活性。I2-KI法无法测定丽萼熊巴掌的花粉生活力,说明其花粉中淀粉含量较低或不含淀粉。同科植物毛菍使用TTC法可将具有活性的花粉染为红色[6],表明同科植物的不同种之间花粉活力测定方式存在差异。使用MTT法测定丽萼熊巴掌花粉活性,有活性的花粉均被染成蓝紫色,根据其上色的深浅能够清晰地分辨花粉的活力强弱(图5)。因此,建议采用MTT染色法测定丽萼熊巴掌花粉活力。

3.2 丽萼熊巴掌的繁育系统

综合杂交指数、套袋实验结果发现,丽萼熊巴掌的繁育系统属异交,部分自交亲和且需要传粉者,这一研究结果还存在于同科植物细叶野牡丹、白花野牡丹、毛菍、枝毛野牡丹中。而花粉胚珠比值显示丽萼熊巴掌的繁育系统属于专性异交,这种根据花粉胚珠比值得出的繁育系统与实际不符并不是个例,如喜树(Camptothecaacuminata)[17]、大花黄牡丹(Paeonialudlowii)[18]等也有类似的现象,故植物繁育系统的确定还需综合杂交指数与套袋实验结果综合考虑。

自然界中,并非所有花都可授粉、坐果并产生种子,授粉成功性的大小可直接影响坐果率的高低,植物坐果率受花粉和资源限制[19]。套袋实验中,丽萼熊巴掌的人工异花授粉坐果率高于人工自花授粉,自然授粉坐果率略高于人工自花授粉坐果率,说明其自花授粉亲和性较低;人工异花授粉坐果率高于自然授粉坐果率,说明其存在花粉限制,这可能与昆虫传粉频率低有关。同时,研究中发现,盛花期开花植株坐果率高于始花期和末花期,说明丽萼熊巴掌还存在着资源限制,始花期和末花期的花序无法获得足够的资源而落花落果严重,从而较难达到生殖成功。查阅相关标本及实地调查发现,原生生境丽萼熊巴掌坐果率高于引种地,结合试验地气候推测,丽萼熊巴掌花期引种地桂林正处于雨季,连续性降雨影响昆虫访花,同时影响花粉的生命力,导致柱头部分粘液流失,后续研究将通过调节降雨变量,探究是否受这一因素影响。其引种结实率低下的原因除了非生物因素(阴雨天气)外,是否还存在群落环境(传粉者)制约,即其野外生境是否存在该种专性传粉昆虫,还有待进一步研究。

3.3 丽萼熊巴掌观花应用前景

丽萼熊巴掌开花进程观察显示,丽萼熊巴掌在花蕾期具有较高的观赏性,花蕾呈玫瑰红色,或白色顶部点缀一些突出的紫红色花瓣(图1 A),可持续约1个月,加上花期,整个观赏期可达2个月。丽萼熊巴掌花期4—5月,而同科其他已开发的园林花卉植物如野牡丹、细叶野牡丹,地菍的花期多为6—8月[20]。野牡丹科植物花部观赏价值很高,很适合用于建立专类观赏植物区,丽萼熊巴掌花期与已开发的同科植物花期不同,正好可延长整个野牡丹科观赏植物的观花期。丽萼熊巴掌高30～100 cm,花朵十分美丽,喜阴,但需要一定的光照,水边、阔叶林下长势及花数明显优于荫蔽林下,自然条件下,背阴区域的丽萼熊巴掌开花较晚。在实际园林应用中可将其种植于湖边或溪边岩石旁与水景相映成趣,亦可将其配植于林下,乔、灌、草搭配种植。我国本土种的花境植物应用较少,开发丽萼熊巴掌花卉资源,对其开花物候及繁育系统进行研究,并将其应用于城市环境美化及盆栽欣赏,对于广西乃至我国建立特色观赏花卉植物资源具有重要意义。