王倩,彭露,兰晓玲,江雪梅,张丽霞,刘刚,刘伟

光动力治疗(photodynamic therapy, PDT)有破坏生物分子并杀伤细胞或微生物的作用,在临床中应用广泛。但近期研究发现,低剂量PDT可对人体细胞起到增殖和功能改善的正向作用。PDT作为嫩肤手段已被广泛认可,近年有研究显示低剂量PDT在改善皮肤光老化的同时,亦增强了皮肤屏障功能,但其改善皮肤屏障的具体机制尚不明确[1]。一些重要的皮肤屏障蛋白,如中间丝相关蛋白、水通道蛋白及紧密连接蛋白等可在一定程度反映皮肤屏障功能,目前尚无低剂量5-氨基酮戊酸光动力疗法(5-aminolevulinic acid-photodynamic therapy, ALA-PDT)影响皮肤屏障蛋白表达的相关报道。本研究拟通过研究低剂量ALA-PDT对人永生化角质形成细胞(HaCaT)中皮肤屏障相关蛋白表达的影响来初步探讨低剂量光动力改善皮肤屏障功能的相关机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 HaCaT细胞,即永生化人角化细胞细胞系,经多次传代后仍保持正常分化能力,常用于人角质形成细胞功能的研究(武汉普诺赛生命科技有限公司),ALA(西安天丰生物科技股份有限公司),含0.25%EDTA胰蛋白酶、MEM培养基、CCK-8试剂盒(北京索莱宝科技有限公司),胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司),TRIZOL试剂、PerfectStart Green qPCRSuperMix及TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)(北京全式金生物技术股份有限公司),鼠抗人丝聚合蛋白(filaggrin,FLG)抗体、鼠抗人紧密连接蛋白(claudin-1,CLDN1)抗体[圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司],兔抗人内皮蛋白(involucrin,IVL)抗体(武汉三鹰生物技术有限公司),兔抗人闭锁蛋白(occludin,OCLN)抗体(杭州华安生物技术有限公司),兔抗人水通道蛋白(aquaporin,AQP3)抗体[艾博抗(上海)贸易有限公司],BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2主要仪器 半导体激光治疗仪[(635±3) nm,武汉亚格光电技术有限公司]、激光功率计(长春镭仕光电科技有限公司)、倒置显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)、实时荧光定量仪、Nanodrop及全功能酶标仪MK3(美国ThermoFisher有限公司)。

1.3HaCaT细胞培养 使用含15%胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素的MEM培养基,于37 ℃、5%CO2条件培养箱中培养;细胞增殖至80%融合时,以含0.25%EDTA胰蛋白酶消化细胞,调整细胞密度至5×104/mL;将HaCaT细胞以5×103/孔的密度接种在96孔板中(内含200 μL完全培养基),培养48 h后,待细胞达到60%～70%融合度时进行后续实验。

1.4最适ALA浓度及照光剂量的摸索 将HaCaT细胞接种于96孔板中,细胞密度为4×104/孔,分别加入0、0.01、0.05、0.1、0.5及1 mmol/L浓度的 ALA孵育4.5 h,每个浓度设4个复孔,使用PBS洗3遍,每孔加入含0.45 mg 葡萄糖的PBS 200 μL,每个浓度分别予以0、0.5、1.85、3.72及10 J/cm2能量的辐照干预[(635±3) nm红光,6.2 mW/cm2,均为到达细胞表面测得的功率密度],照射完成后继续培养48 h,进行CCK-8检测。

1.5HaCaT细胞活性检测 按上述条件处理HaCaT细胞后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,在37 ℃继续孵育1 h,使用酶标仪在450 nm处检测吸光度值,每组各重复3次。

1.6实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR, qPCR)检测皮肤屏障相关蛋白mRNA的表达 用TRIZOL法提取各组HaCaT细胞的总RNA,Nanodrop测定RNA浓度及纯度,取等量RNA进行逆转录,得到对应cDNA,再通过qPCR检测皮肤屏障相关蛋白FLG、IVL、AQP3、CLDN1及OCLN的mRNA水平,qPCR引物序列见表1。反应体系如下:2×PerfectStart Green qPCRSuperMix 10.0 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA模板1.0 μL,无核酸酶水8.2 μL。反应条件:以95 ℃ 10 min预变性,95 ℃ 10 s变性,60 ℃ 30 s退火,72 ℃ 10 s延伸,重复40个循环。每个样本设三个复孔,取其平均Ct值,以GAPDH为内参,通过2-△△Ct计算mRNA相对表达量,共重复3次。

表1 皮肤屏障相关蛋白引物序列及产物大小

1.7Western blot检测皮肤屏障相关蛋白在蛋白水平的表达 用含有蛋白酶抑制剂的RIPA法提取细胞总蛋白质,BCA法测定蛋白浓度,使用凝胶电泳进行蛋白分离,随后将蛋白通过转膜转移至NC膜上,最后进行封闭及一、二抗孵育。一抗稀释比例如下: FLG 1∶200,IVL 1∶1 000,AQP3 1∶1 000,Claudin-1 1∶200,Occludin 1∶500,GAPDH 1∶10 000);用化学发光图像分析成像系统进行曝光及图像采集,结果以目的蛋白相对表达量表示。目的蛋白相对表达量=目的蛋白积分光密度值(IOD)/内参积分光密度值(IOD)。

2 结果

2.1不同剂量ALA-PDT处理下HaCaT细胞形态学观察 HaCaT细胞接种48 h后使用倒置显微镜观察,HaCaT细胞为贴壁状态,上皮细胞样,汇合连接成片。0.1 mmol/L及以下浓度ALA联合不同照光能量处理后对细胞形态及贴壁状态无明显影响;0.5 mmo/L及1 mmo/L ALA联合1.85 J/cm2及以上照光能量时细胞呈现脱离贴壁状态,形态出现明显皱缩,结构不完整,细胞密度骤减,见图1。

2.2不同剂量ALA-PDT对HaCaT细胞活力的影响 采用CCK-8法对细胞活力进行检测,结果显示,ALA在0.1 mmol/L及以下浓度时,予以不照光及不同照光能量处理对细胞活力影响均不大,甚至有促进细胞活力的作用;在0.1 mmol/L ALA+3.72 J/cm2照光能量参数下具有最高促进效应。该参数处理与无处理(0 mmol/L ALA+0 J/cm2)相比,差异有统计学意义(t=6.877,P=0.000),为低剂量ALA-PDT促进HaCaT细胞活力的最适ALA浓度及照光能量。而ALA浓度在0.5 mmo/L和1 mmo/L时,照光能量为0.5 J/cm2时细胞存活率轻度下降,随着照光能量继续增大,细胞存活率明显下降,绝大部分细胞死亡,见图2。因此选取0.1 mmol/L浓度ALA及3.72 J/cm2照光能量用于后续实验。

2.3低剂量ALA-PDT对皮肤屏障相关蛋白mRNA表达的影响 将HaCaT细胞分为对照组(无处理)、光照组(3.72 J/cm2红光)、ALA组(0.1 mmol/L ALA)、低剂量PDT组(0.1 mmol/L ALA+3.72 J/cm2),分别予以相应处理,48 h后qPCR检测皮肤屏障相关蛋白mRNA的表达。结果显示,低剂量PDT组的FLG mRNA表达水平较对照组、光照组及ALA组均明显升高,差异有统计学意义(F=4.318,P=0.044);AQP3 mRNA在低剂量PDT组中的表达水平较对照组及ALA组均明显升高,差异有统计学意义(F=5.386,P=0.025); IVL、CLDN1及OCLN mRNA表达水平在几组中差异无统计学意义(均P>0.05),见表2。

2.4低剂量ALA-PDT对皮肤屏障相关蛋白在蛋白水平表达的影响 对照组、光照组、ALA组及低剂量PDT组经过上述处理,48 h后Western-blot检测皮肤屏障相关蛋白表达。结果显示,FLG、IVL、AQP3及Claudin-1蛋白表达水平在低剂量PDT组均明显高于空白组、光照组及ALA组(F=8.800、17.222、13.684、5.898,P=0.006、0.001、0.002、0.020);Occludin的蛋白表达水平在几组细胞中差异无统计学意义(F=2.195,P=0.166),见图3。

图2 不同剂量ALA-PDT对HaCaT细胞活力的影响

表2 不同处理后HaCaT细胞中FLG、IVL、AQP3、CLDN1及OCLN mRNA的相对表达量

Note:*P<0.05,**P<0.01 vs.low-dose PDT;NS indicated no significance.

3 讨论

光动力技术是利用光敏剂作为介导,将特定波长光的能量传递到靶组织的光化学反应技术。由于PDT靶向选择性高、创伤小、美容效果好等优势,近年来在临床中得到广泛应用。在皮肤科,PDT主要用于治疗皮肤肿瘤、痤疮、尖锐湿疣等疾病,均是利用PDT对异常增生细胞或病原体的杀伤作用。但近年研究发现,除了常规剂量PDT对细胞的杀伤作用,低剂量PDT可在促进细胞增殖和分化、启动和维持重塑等方面起到正向作用[2-3]。近年来低剂量PDT已被较多地用于皮肤年轻化的治疗,取得了良好疗效并且疼痛等副作用轻微[4-6]。有趣的是,在低剂量PDT改善光老化的研究中,有研究发现它能同时改善皮肤屏障功能,使受试者的角质层含水量增加、经皮水丢失减少[7-9]。理论上来说,位于皮肤最外层的角质层由于直接接触光敏剂并且离辐射最近,所以临床进行光动力治疗时难以避免出现局部皮肤的红肿与脱屑,在短期内对表皮的屏障功能并无益处。目前这些试验,几乎是在疗程结束后数周至数月后观察到的结果。其中有学者提到,PDT治疗区域在随访初期显示出一过性的角质层含水量降低和经皮水分流失增多,反映了皮肤屏障损伤,但该两项指标在随访后期均优于治疗前水平,说明光动力治疗对皮肤屏障最终为有利影响[9]。所以,在这些研究中,皮肤屏障功能指标的提升是PDT治疗的后期效应。有学者认为这可能与PDT清除异常的表皮细胞使得表皮细胞趋于正常化有关[1]。

平常所说的皮肤屏障通常是指狭义的皮肤屏障,即物理性屏障结构,由角质层和紧密连接构成,两者共同阻止了外部抗原由外向内的渗透或内部成分由内而外的泄漏[10]。皮肤屏障中的多种关键蛋白对于维持正常的屏障功能非常重要,如中间丝相关蛋白(FLG、IVL等)、水通道蛋白(AQP3等)、紧密连接蛋白(Claudin-1、Occludin等)[11-14]。FLG与角蛋白中间丝相互作用形成致密的角蛋白纤维束,IVL是角质化包膜的重要组成部分,角质化包膜包裹角蛋白纤维束形成不溶性的角质屏障结构。AQP3是细胞膜上的转运蛋白,跨膜转运水、甘油、尿素等小分子物质,在皮肤水合、维护皮肤屏障等方面也有重要作用。紧密连接的主要组成部分包括Claudin蛋白、Occludin蛋白等,可参与维持紧密连接的栅栏功能及细胞旁弥散等。皮肤屏障相关蛋白的结构及功能障碍可能导致屏障损伤、表皮炎症反应及影响表皮分化等。那么是否可以将光动力的参数设置到足够低的剂量,使其对上诉这些重要的皮肤屏障蛋白的表达直接产生影响,从而起到短期内改善皮肤屏障的作用呢?

低剂量PDT通常是指低浓度的光敏剂和/或低水平光照剂量,但其具体参数并无确切标准。既往有学者认为是具有亚致死性的光敏剂和/或光的PDT,具有免疫调节作用,能保持细胞活力完好[15]。文献报道,对于HaCaT细胞,使用0.1 mmol/L ALA甲酯孵育5 h,在细胞培养位置获得3.72 J/cm2LED红光的照光能量可以起到促进细胞增殖的效果,并且不会产生遗传毒性损伤[16-17]。Jang等[18]发现0.1 mmol/L ALA孵育30 min并照射3 J/cm2红光的低剂量ALA-PDT促进成纤维细胞的增殖,这是由于在该PDT条件下,细胞内低水平活性氧的产生诱导了成纤维细胞ERK通路激活的延长。Chen等[19]的研究结果显示低剂量ALA-PDT(0.1 mmol/L ALA+21 J/cm2) 通过 Nrf2介导的抗氧化作用减少UVA介导的光老化。还有研究显示,使用0.1 mmol/L ALA和4 J/cm2635 nm红光处理表皮干细胞可使细胞迁移率显著增高[20]。以上研究均说明适当的低剂量PDT参数可对细胞产生直接正向效应。该研究也发现0.1 mmol/L ALA及3.72 J/cm2辐照能量[(635±3) nm红光]是能促进HaCaT细胞活力的最适ALA浓度及照光剂量,所以笔者利用此参数在体外初步研究低剂量PDT对皮肤屏障蛋白的影响。

本研究显示,在此参数设置的低剂量ALA-PDT的作用下,HaCaT细胞中FLG及AQP3 mRNA相对表达量较对照组、光照组及ALA组明显升高,有统计学意义,IVL、CLDN1及OCLN mRNA表达量也有上升趋势,从转录组水平证明了低剂量ALA-PDT对一些重要的皮肤屏障蛋白的有益作用。同时采用Western blot进行蛋白水平的验证,结果显示低剂量ALA-PDT对于促进皮肤屏障蛋白表达的优势依然存在,除了Occludin外,低剂量PDT组HaCaT细胞中FLG、IVL、AQP3、Claudin-1蛋白表达的水平均较其余几组显著升高,进一步从蛋白水平证实了低剂量PDT可以直接促进部分皮肤屏障蛋白的表达。以上结果说明,足够低剂量的PDT可能直接作用于表皮屏障功能的主要载体角质形成细胞,通过提高FLG、IVL、AQP3、Claudin-1等重要的皮肤屏障蛋白水平来促进角质形成细胞分化、维持皮肤水合、稳定细胞连接,从而达到改善皮肤屏障功能的作用。

综上所述,0.1 mmol/L ALA及3.72 J/cm2红光的低剂量光动力能直接促进HaCaT细胞的活力;该低剂量ALA-PDT可能直接通过提高HaCaT细胞中FLG、IVL、AQP3、Claudin-1等关键的皮肤屏障蛋白的表达来改善皮肤屏障功能,但其具体机制仍有待进一步深入研究。