钟世顺 梁玮 许炎钦 刘进生

结肠癌是全球第三常见的恶性肿瘤，也是第二常见的恶性肿瘤死亡原因[1]。结肠癌的发生与环境、饮食、肠道微生物等因素有关[2]。已有研究表明，肠道微生物会多方面影响肠道健康，包括对肠道细胞特征、新陈代谢和免疫的影响[3，4]。肠道微生物是寄居在人体肠道内的庞大、复杂的微生物群落[5]。益生菌是一类重要的肠道微生物，可以通过平衡肠道微生物菌群和增强消化系统中的营养吸收，对宿主产生有利影响[6]。

双歧杆菌属是常见的益生菌。双歧杆菌是一种革兰氏阳性、不运动、细胞呈杆状、一端有时呈分叉状的厌氧细菌。其能够合成氨基酸、硫胺素和核黄素，是肠道菌群的重要组成成员之一，在抑制肠道病原体的定植、保持肠道微生物稳态、保护肠道黏膜屏障的完整性等方面发挥着重要作用[7]。已有研究表明，双歧杆菌可以调节小鼠肠道菌群组成，提高短链脂肪酸含量，提高肠道屏障相关基因的表达，进而有效缓解小鼠溃疡性结肠炎[8]。除了缓解肠炎方面的研究外，Bahmani 等[9]研究发现双歧杆菌能抑制结肠癌细胞的生长。本研究评估体外条件下双歧杆菌对人结肠癌DLD-1 细胞系增殖、侵袭及迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养结肠癌细胞系DLD-1 从美国典型培养物保藏中心（American type culture collection，ATCC）获得，DLD-1 细胞培养在含10%胎牛血清的PRMI-1640 培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱培养。

1.2 细菌培养将双歧杆菌在培养基中培养18h，室温5 000g 离心4min 收获双歧杆菌细胞，并将其重新悬浮在培养基，制备成1×108CFU/ml 的双歧杆菌悬液。

1.3 CCK-8 实验将DLD-1 细胞按照2 000 个/孔的数量加到含180μl 完全培养基的96 孔板中。实验组中每孔加入20μl 的1×108CFU/ml 双歧杆菌悬液（双歧杆菌终浓度为1×107CFU/ml），对照组中每孔加入20μl 的培养液。每组包含6 个复孔，设置0、24h、48h、72h 4 个时间梯度。将细胞置于培养箱中培养。测量时在培养孔中加入10μl CCK8 试剂后置于37℃静置1h。在460nm 波长处测量每个培养孔的OD 值。

1.4 划痕实验将DLD-1 细胞以每孔1×106个接种于6 孔板之中，每组设置3 个复孔，随后置于37℃，5%CO2培养箱培养。待细胞与细胞之间契合并铺满整个6 孔板时，借助直尺用10μl 的枪头在6孔板中划出九宫格，枪头划过的地方形成没有细胞的区域，用适量的PBS 洗涤培养孔3 遍，吸去PBS，而后每孔加入1.8ml 无血清培养基，实验组每孔中加入200μl 的1×108CFU/ml 双歧杆菌悬液，对照组中每孔加入200μl 的培养液。接着进行观察拍照和记录，拍摄完毕后置于37℃，5%CO2培养箱培养。培养48h 后，吸去无血清培养基，用PBS 洗涤3 次后再次加入2ml 无血清培养基，对划痕区域进行拍照，并记录比对观察迁移情况。

1.5 Transwell 实验取一块新的24 孔板，每孔加入270μl 完全培养液，实验组每孔加入30μl 的1×108CFU/ml 双歧杆菌悬液，对照组每孔加入30μl的培养液。将Transwell 小室放入含有完全培养液的24 孔板内，将小室的基质膜水化，在Transwell 小室上方加入180μl 无血清培养基，实验组每孔加入20μl 的1×108CFU/ml 双歧杆菌悬液，对照组每孔加入20μl 的培养液。将DLD-1 细胞以每孔1×104个接种于小室中，每组设置3 个复孔，置于37℃，5%CO2培养箱继续培养。培养24h 后，取出小室，用移液枪吸取小室中的培养液，使用棉签小心地擦去小室基质膜上层细胞，在新的24 孔板中加入400μl 结晶紫染液，将擦干净的小室放入带有结晶紫染液的孔洞中染色15min。染色后用移液枪吸取染色液，用棉签擦去基质膜周围多余的结晶紫染液。显微镜观察小室并拍照记录。

1.6 统计学分析CCK8 分析采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）方法进行分析，两组间的差异分析采用Studentt检验方法进行分析，P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 双歧杆菌抑制结肠癌细胞DLD-1增殖CCK-8实验结果表明，相比于对照组，双歧杆菌组的结肠癌细胞DLD-1 的增殖能力显著被抑制（P<0.01），见图1。

图1 两组结肠癌细胞DLD-1增殖能力

2.2 双歧杆菌抑制结肠癌细胞DLD-1 侵袭及迁移划痕实验结果表明，相比于对照组，双歧杆菌可以显著抑制结肠癌细胞DLD-1 的迁移（P<0.01），Transwell 实验结果表明，相比于对照组，双歧杆菌可以显著抑制结肠癌细胞DLD-1 的侵袭能力（P<0.01）。见图2、3。

图2 双岐杆菌对结肠癌细胞DLD-1 迁移能力的影响

图3 双岐杆菌对结肠癌细胞DLD-1 侵袭能力的影响

3 讨论

结肠癌是常见的消化道肿瘤。近年来，我国结肠癌的发病率和死亡率逐年上升，均位列我国恶性肿瘤前5 位[10]，局部的复发和转移是治疗失败的主要原因。结肠癌发病机制复杂，受多种因素影响。有研究显示，肠道菌群在结肠癌发生、发展过程中发挥重要作用[11]。人类肠道中包含大量的微生物菌群，肠道菌群的变化对宿主的生理有重要影响，比如肠道菌群能影响免疫系统发育及调控肠道相关代谢功能等[11]。

双歧杆菌和乳酸杆菌是人类肠道菌群中重要的益生菌，具有增强免疫力和抗肿瘤功能。大多数结肠癌患者存在肠道菌群失调的现象，其肠道有益菌如双歧杆菌及乳酸杆菌等较健康人群减少[12]。一项关于益生菌预防肠癌的作用机制的研究发现，肠道菌群是影响肠癌进展的最关键风险因素，它能够平衡肠道菌群，减缓肠癌进展。2017年，Hibberd等[13]研究发现益生菌能干预肠癌患者的肠道微生物菌群，对肠癌患者的治疗有潜在的作用。

作为一种重要的益生菌，双歧杆菌对肠道健康有重要影响，可抑制吸附于肠道上皮细胞的病原体的生长，其主要代谢物乳酸和乙酸均能降低肠道内的pH 值，进而抑制许多有害微生物的生长。因此，通过调节肠道内的pH 值是双歧杆菌发挥肠道益生菌功能的重要机制之一。此外，还有多项研究表明双歧杆菌能影响结肠癌的进展。Foo 等[14]通过细胞实验表明，双歧杆菌具有抑制抗凋亡蛋白表达，增强促凋亡蛋白表达的作用，进而诱导结肠癌细胞凋亡，抑制结肠癌的进展。大鼠实验数据表明，与未服用双歧杆菌的大鼠相比，服用双歧杆菌的大鼠结肠癌的癌前病变可以降低25%左右。另一项结肠癌大鼠模型实验结果表明，双歧杆菌等益生菌的混合物可以调节平衡大鼠肠道微生物的组成，进而下调结肠癌的发生率[15]。Liang 等[16]研究了益生菌对直肠癌患者的影响，结果表明双歧杆菌三活胶囊对直肠癌患者症状有显著改善作用。

本研究主要通过CCK8、划痕及Transwell 实验探究双歧杆菌对结肠癌细胞DLD-1增殖、侵袭及迁移的影响。结果表明，双歧杆菌可以显著抑制结肠癌细胞DLD-1增殖、侵袭及迁移能力。本研究相关内容可以为结肠癌的临床治疗和预防提供一定的理论参考。