范宇华，付芸，李浩然，万楚琦

（1.长春理工大学 光电工程学院，长春 130022；2.长春理工大学 空间光电技术研究所，长春 130022）

糖皮质激素（Glucocorticoids，GLUs）是一种类固醇激素[1]，可从人体的肾上腺皮质分泌，也可人工合成。糖皮质激素不仅在生物体内的糖、蛋白质和脂肪等合成及代谢过程中起着重要的调节作用[2]，在药用方面也体现着重要的价值[3]，如一定量的糖皮质激素能起到抗炎的作用，可抑制毛细血管扩张、缓解水肿；还可调节体温，缓解多种症状引起的发热；还有抗过敏的作用[4]。但近年来，糖皮质激素滥用[5-6]现象广泛存在，如大剂量、长周期使用糖皮质激素，引发依赖性；把糖皮质激素随意当作退热药、镇痛药和抗菌药使用；或用在诊断不明的病例上缓解症状；更有甚者在商品中违禁添加糖皮质激素，如动物饲料[7]、化妆品[8]中等。但糖皮质激素的滥用会引发人体免疫功能障碍[6]，如体内淋巴细胞的数量下降，抵抗力变弱；还会对人体多种系统造成影响，如骨髓造血系统，使红细胞和血小板等的数量增多，抑制白细胞抗炎的功能，使消化系统紊乱，如诱发胃溃疡[9]等。人体长期每天使用超过30 mg 的糖皮质激素会造成依赖性；人体每天使用超过100 mg 的糖皮质激素可导致严重副作用；如果每天的使用量为250 mg或以上时，则仅能用药数日后就需停药。

糖皮质激素的检测对于应对非法添加、违规使用和限用等问题有着重要意义。现有的糖皮质激素检测方法有很多种，广泛使用的有高效液相色谱法（High Perform Liquid Chromatography，HPLC）[8]、超高效液相色谱法-串联质谱（Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）[10]等主流检测方法，也有采用微固相萃取[11]、免疫层析[12]和电化学分析[13]的方法，但这些方法存在仪器昂贵、设备体积大不易携带、对操作人员的技术专业性要求过高、处理繁琐、检测周期长的缺陷，不适用于监管部门和生产企业现场大量样本快速检测的需求。

拉曼光谱技术[14]是一种高精度、灵敏、快速和无损的分子检测手段，有着“指纹”图谱分辨能力。具有拉曼活性的物质有着对应的拉曼特征峰位，拉曼特征峰强度随浓度的变化有着高低的变化，可根据拉曼峰特征建立数学模型，快速鉴别物质种类和浓度。拉曼光谱是一种强有力的物质分析手段。拉曼光谱在糖皮质激素检测上有着广泛的应用，如Li 等人[15]应用薄层色谱结合斑点拉曼散射法建立了一种同时快速检测膳食补充剂中非法添加的6 种糖皮质激素的方法。修梓侨等人[16]通过激光拉曼光谱分析了地塞米松的内部结构和拉曼光谱关系，可快速准确地检测出地塞米松。

本研究搭建了一种小型化的拉曼光路，采用532 nm 激光器对糖皮质激素地塞米松和氢化可的松固体样本和不同浓度的二甲基亚砜溶液进行了拉曼光谱测试，探讨应用拉曼光谱实现糖皮质激素定量检测的关键技术，针对多种预处理及回归方法进行分析比较，得出了一种可以在实验中快速进行拉曼检测的方法。本方法实现了准确测定糖皮质激素的浓度，为糖皮质激素的精准分析提供方案策略。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

激发光源（MSL-FN-532，532 nm，新产业），保护银反射镜（RSR20-D254，锐纳光学），分光棱镜（CCM1-BS013/M，thorlabs），平场无限远消色差显微物镜（20 倍，永新光学），滤光片（537 nm，OD6+，新产业），聚焦透镜（GCL-010601，大恒光电，f′=200 mm），角度反射探头（海洋光学），光谱仪（sunshine 系列，探测范围：530～720 nm，共1 958 个数据点，新产业），分析天平（UW620H，岛津制造所），石英比色皿（3.5 mL，两光通）。

地塞米松（分析纯，麦克林），氢化可的松（分析纯，麦克林），二甲基亚砜（分析纯，福晨化学），无水乙醇（分析纯，富宇试剂），样品试剂皆为分析纯。本实验使用的所有玻璃仪器均经过超纯水清洗，实验使用水均为Milli-Q 纯化的超纯水（＞18.2 MΩ·cm）。

1.2 实验光路

本文采用显微拉曼测试系统，激发光源波长采用532 nm。如图1 所示，激光器发出的激光经过可调节衰减器，调节输出光功率同时输出线偏振光，线偏振光经四分之一波片后变为圆偏振光，经折转光路调节出光高度，后由分光棱镜分光，一束经过显微物镜将光斑聚集到装有被测样品的石英比色皿中，被激发的拉曼散射光由显微物镜收集回来，再经537 nm 长波通滤光片将瑞利散射光强衰减至和拉曼散射光强度在同一数量级上，通过滤光片的拉曼散射光经聚焦透镜后聚焦，由光纤探头将拉曼散射信号传输至光谱仪。

图1 拉曼光谱采集原理框图

图2 所示为自行搭建的拉曼光谱采集实验平台。

图2 拉曼光谱采集实验平台

1.3 样品制备

糖皮质激素标准溶液配制：分别制备地塞米松与氢化可的松二甲基亚砜溶液10 mg·mL-1、20 mg·mL-1、30 mg·mL-1、40 mg·mL-1、50 mg·mL-1、60 mg·mL-1、70 mg·mL-1、80 mg·mL-1、90 mg·mL-1、100 mg·mL-1共10 个浓度梯度的标准液。分别制备1 mg·mL-1地塞米松与氢化可的松无水乙醇溶液。

1.4 拉曼光谱仪的校正及拉曼光谱采集

拉曼光谱仪的校正及光谱采集工作在Spectral Analysis 软件下完成。为保证拉曼光谱测量的准确性，需进行拉曼光谱仪的校正，对激光波长进行校准：在拉曼频移为零位置处进行校正，即在拉曼测试之前，不放样品，拿掉537 nm 长波通滤光片，用光谱仪测量激光器激发波长为533.206 nm，在“Spectral Analysis”软件进行激发波长参数设定时输入533.206 nm，之后测得在拉曼频移为零位置处的强度最大，则该波长为当前激光器激发波长校准值，安装滤光片后输入该波长重新进行暗光谱采集，此时完成激光波长校准工作[17]。

运用“Spectral Analysis”软件完成数据采集及参数设定工作，积分时间10 s，开始采集拉曼光谱之前，关闭激光器，避免环境光等对测试结果的影响，保存并扣除暗光谱，激发功率约200 mW，样品置于石英比色皿中，每个标准溶液取20 个采样点，每点采5 次取平均；采集地塞米松与氢化可的松固体粉末的拉曼光谱；采集地塞米松与氢化可的松无水乙醇溶液拉曼光谱；采集地塞米松与氢化可的松二甲基亚砜溶液拉曼光谱。

1.5 模型的建立及评价

为提高信噪比，对比了基于不同参数的移动窗口平均法（Moving Window Averaging，MWA）、移动窗口中位值法（Moving Window Median，MWM）、Savitzky-Golay 卷积平滑法（SG）和小波阈值法（Wavelet Threshold，WT）的去噪效果。采用信噪比（Signal to Noise Ratio，SNR）和均方根误差（Root Mean Square Error，RMSE）作为评价指标，去噪后的拉曼光谱作为标准信号，与噪声的比值作为信噪比，计算公式如下：

式中，f(i)为原始含噪声拉曼光谱；为去噪后的拉曼光谱；n为拉曼光谱长度。

为消除荧光背景的干扰，对比自适应迭代重加权惩罚最小二乘法（Adaptive Iterative Reweight⁃ing Penalized Least Squares，airPLS）、不对称最小二乘法（Asymmetric Least Squares，ALS）和BEADS（Baseline Estimation Add Denoising With Sparsity）算法的基线校正效果。

以3∶1 比例将每种浓度的糖皮质激素标准溶液样品划分为训练集和测试集，利用连续投影算法（Successive Projections Algorithm，SPA）选取特征波数来改善模型，特征波数的数量限定在1～30 之间。应用多元线性回归（Multivariable Linear Regression，MLR）、主成分回归（Principle Component Regression，PCR）、偏最小二乘回归（Partial Least Squares Regression，PLSR）、BP 神经网络（Back Propagation，BP）、和基于线性、多项式、RBF、sigmoid 核函数的支持向量回归（Support Vector Regression，SVR）算法建立定量分析模型。根据决定系数（R2）和均方根误差（RMSE）评价模型的性能。计算公式如下：

式中，yi表示实际浓度值；fi为预测 值；是实际浓度的平均值；N为样本数。决定系数R2越接近1，回归效果越好；RMSE 越小，模型预测能力越强。在Matlab R2019a 下对数据进行处理。

2 结果与讨论

2.1 糖皮质激素拉曼光谱特征分析

图3 为地塞米松和氢化可的松固体拉曼光谱的对比图，二者具有结构上的相似性，地塞米松和氢化可的松都存在一对强度较高的双峰，特征峰各自位于1 611 cm-1、1 662 cm-1和1 614 cm-1、1 647 cm-1，分别源自环己二烯结构的双键伸缩振动和环己烯结构的双键伸缩振动，不同之处在于氢化可的松的双峰强度相当、峰形相似、峰距较窄，而地塞米松受环己二烯结构的影响导致其中一峰强度被衰减，两峰强度差距较明显[15]。地塞米松2 947 cm-1和氢化可的松2 951 cm-1受甲基非对称伸缩振动影响表现较强[16]，地塞米松534 cm-1和691 cm-1峰归属于C-F 的影响[18]。

图3 糖皮质激素固体粉末的拉曼光谱图

2.2 糖皮质激素定量分析的溶剂选择

图4（a）和图4（b）为两种糖皮质激素在无水乙醇中的拉曼光谱，图4（c）和图4（d）为两种糖皮质激素在二甲基亚砜中的拉曼光谱，地塞米松和氢化可的松略溶于无水乙醇，两者在无水乙醇中的溶解度达不到光谱仪的拉曼检测限，在该溶液状态下无法分辨两者的拉曼峰；在二甲基亚砜溶液中，地塞米松在1 611 cm-1、1 662 cm-1和氢化可的松在1 614 cm-1、1 647 cm-1位置处最强的双峰均清晰可见，以上峰位受二甲基亚砜溶剂的影响均发生了红移，分别红移到1 617 cm-1、1 668 cm-1和1 620 cm-1、1 668 cm-1位置处。但是，地塞米松2 947 cm-1和氢化可的松2 951 cm-1特征峰与二甲基亚砜2 922 cm-1位置处发生谱峰重叠，地塞米松1 452 cm-1和氢化可的松1 442 cm-1特征峰以下的低波数区多为弱峰且与二甲基亚砜的低波数区存在多处重叠。因此，适合选择两种糖皮质激素在二甲基亚砜溶液中双峰作为特征，为糖皮质激素定量分析提供判断的依据。

2.3 糖皮质激素拉曼光谱的预处理

受光源稳定性和环境影响，原始光谱数据中除有用信号外还有许多噪声信号和荧光背景，如图5 所示。需对原始光谱信号进行预处理。

图5 原始光谱

比较了基于不同参数的MWA、MWM、SG 和WT 去噪算法，表1 为各方法不同参数下SNR 和RMSE 的最优值。通过对比分析发现，当MWA 与MWM 窗口宽度过小时，滤波有残留，而窗口过大时，光谱信息易丢失，其中MWM 较适合抑制拉曼光谱中的尖峰或异常点噪声。由表1 可见WT法明显优于MWA 和MWM 法。SG 法虽能有效地保留光谱的特征峰信息，但去噪效果不理想。

表1 不同去噪方法SNR 和RMSE 的最优值

小波软阈值在去噪光滑性上优于小波硬阈值，但会损失高频信息[19-20]。表1 参数下的小波软阈值法与真实信号的接近程度次于小波硬阈值法，因此，采用SNR 最高、RMSE 最小的小波基为coif3、分解层数为3 的小波硬阈值法，可在去噪效果较好的情况下保留了拉曼光谱的大部分特征信息，图6 为该参数下两种糖皮质激素的去噪光谱。

图6 糖皮质激素的去噪后光谱图

荧光背景表现为变化平缓的低频信号，而拉曼信号表现为较陡峭的高频信号。如图6 所示，荧光背景表现为由高低波数位置向中间波数位置上升的现象，影响拉曼定量分析的后续处理。图7（a）、图7（b）、图7（c）和图7（d）分别表示为去噪后的光谱再经过airPLS 和ALS 法基线校正后的光谱。采用airPLS 和ALS 法进行基线校正时，虽能保持拉曼光谱的峰形，但存在复杂荧光背景下基线不能完全校正的现象。如果先插值再用BEADS 算法处理，不仅能保留光谱数据中有用信息，还能近乎完整地扣除荧光背景，得到平整的光谱基线，如图7（e）和图7（f）所示。

图7 基线校正光谱图

2.4 糖皮质激素拉曼光谱特征提取及定量分析

选取基线校正后1 550 cm-1～1 750 cm-1两种糖皮质激素特征峰波数区间光谱数据，使用SPA 法从1～30 个特征波数中选出4 个特征波数得到最小均方根误差，分别为4.854 8 和4.421 0，地塞米松的特征波数位于1 664 cm-1、1 670 cm-1、1 683 cm-1、1 690 cm-1，氢化可的松的特征波数位于1605 cm-1、1 611 cm-1、1 663 cm-1、1 671 cm-1，如图8 所示。

图8 SPA 特征提取图

将SPA 提取的4 个波数作为变量输入至不同回归模型中，建模结果如表2 和表3 所示。可以看出，建模样本中基于RBF 核函数的SVR 所得模型效果最好，其他方法拟合效果欠佳。通过测试集验证模型的性能，对于地塞米松和氢化可的松，SVR 模型的RP2分别为0.994 4 和0.995 9，相较于其他模型更接近1。 RMSEP 分别为2.527 4 mg·mL-1和1.750 4 mg·mL-1，表明有更多的预测样本聚集在实际浓度值附近。

表2 地塞米松数据集建模和预测效果

表3 氢化可的松数据集建模和预测效果

基于RBF 核函数的SVR 模型对地塞米松和氢化可的松的建模效果和预测效果如图9 所示，模型整体的预测准确性较高、稳健性较好，只有少数预测样本偏差略大，其中，在90 mg·mL-1的样品处出现了较大的偏差。经与实验记录对比发现，测量时环境光强产生了较大波动，引起荧光背景的突变，在后续基线校正处理中使得部分有用的光谱信息被误认为荧光背景，致使该浓度下的光谱强度出现偏差，造成样品浓度预测偏差较大。

图9 基于RBF 核函数的SVR 算法建模效果和预测效果

3 结论

本文针对糖皮质激素滥用的问题，设计了一种精准进行糖皮质激素浓度检测的方法。采用532 nm 激光器对两种糖皮质激素的二甲基亚砜溶液进行拉曼测试分析，发现受二甲基亚砜溶剂 的 影 响，地塞 米松 在1 611 cm-1、1 662 cm-1和氢化可的松在1 614 cm-1、1 647 cm-1位置处的双峰均发生了红移。采用小波基为coif3、3 层分解的硬阈值法去噪时，SNR 最高为45.822 7。经过对比发现，对于具有强荧光背景的糖皮质激素二甲基亚砜溶液的拉曼光谱，BEADS 算法能在保留其拉曼光谱峰形的前提下更好地消除荧光背景。相较于其他方法，基于RBF 核函数的支持向量回归模型获得了较好的分析性能，对于地塞米松和氢化可的松该定量分析模型预测集决定系数（RP2）分别为0.994 4 和0.995 9，均方根误差（RMSEP）分别为2.527 4 mg·mL-1和1.750 4 mg·mL-1，所建立的定量分析模型具有良好的准确性、精密度。可解决现有分析技术手段耗时长、检测成本高、操作复杂等问题，为有效监测糖皮质激素的滥用问题提供了技术支持。研究表明拉曼光谱能够测定糖皮质激素，但拉曼光谱的检测精度仍有很大的提高空间，在后续的研究中，将通过表面增强拉曼技术提高检测方法的灵敏度，满足更多领域的检测需求。