潘映秋，夏慧丽，洪亮，李兆奎，卢启寰，周晶莹

台州市药品检验研究院·台州市食品检验检测中心 （浙江台州 317700）

冬虫夏草为麦角菌科冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上形成的幼虫尸体及子座的复合体，为国家二级保护名贵药材[1]。虫草品类繁多，传统中医药学中的冬虫夏草特指分布于我国青藏高原及边缘地区高寒草甸中的具有特殊药用功效的冬虫夏草菌，其寄主为蝠蛾幼虫[2]。由于冬虫夏草野生资源分布区域狭窄，人工培植技术尚不成熟，市场需求量大，价格节节攀升，供需严重失衡，昂贵的价格和稀缺的资源导致市场上的冬虫夏草以次充好、掺假充真的现象屡禁不止，无法保证其临床疗效和食用安全。目前常用的性状鉴别、显微鉴别和化学鉴别方法易受外界因素及生物体发育阶段的影响，特别是缺少对冬虫夏草粉及制剂等因加工丧失外观特性产品的有效监管手段[3]。

近年来，分子鉴别作为新兴的中药材鉴定手段，通过核酸或蛋白等大分子物质特征对冬虫夏草进行鉴别，具有准确性高、重现性好等优点，在冬虫夏草鉴别中的应用研究亦日益深入[4-6]。目前已有SN/T 3957-2014《冬虫夏草真伪鉴别 实时荧光PCR方法》[7]鉴别标准，但其仅可作为定性检测手段，无法对冬虫夏草进行定量检测。因此，亟需一种可靠的冬虫夏草定量检测方法对冬虫夏草进行鉴别及掺伪检测，以保证冬虫夏草市场流通的规范性、食用的安全性和治疗的有效性。

数字聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）作为第三代PCR 技术，可不依赖标准曲线进行绝对定量，在微生物丰度、病毒载量、罕见基因突变及食品源性成分定量检测等方面均有应用研究[8]，但尚未见该方法在中药鉴伪中的应用。本研究旨在探究基于微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技术的冬虫夏草绝对定量检测方法，探寻一种精准、快速定量检测冬虫夏草及其制品的检验手段。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器

QX200 微滴式数字PCR 仪（Bio-Rad）、ViiA7 荧光定量PCR 仪（ABI）、T100 PCR 扩增仪（Bio-Rad）、高通量组织研磨仪（Biotage Lysera）、Nanodrop One 超微量核酸蛋白测定仪（Thermo）、全自动核酸蛋白分析仪（Qsep100）、低温冷冻离心机（Thermo ST8R）。

1.2 试剂

基因组DNA 提取试剂盒（Axgen）、引物与探针[由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]、ddPCRTMSupermix for Probes（No dUTP）（Bio-Rad）、2×TaqMan Master Mix（Takara）、Ex Taq Hot Start Version（Takara）。

1.3 材料

冬虫夏草（批号：121201-201103）和发酵冬虫夏草菌粉（批号：121612-201402）均为国家药品标准物质，购自中国食品药品检定研究院；伪品亚香棒虫草、新疆虫草、古尼虫草、蛹虫草和虫草花均经台州市药品检验研究院鉴定，于室温干燥环境下保存；市售西藏冬虫夏草、青海冬虫夏草、冬虫夏草粉、金水宝胶囊、百令片、虫草清肺胶囊、复方虫草养血颗粒、复方虫草口服液，均购自流通市场。

2 方法

2.1 DNA 提取

样品前处理：对于对照药材，直接称取干燥粉末；对于虫草样品，称取1.0 g 并用高通量组织研磨仪直接研磨为粉末，称取干燥粉末；对于固体制剂样品，称取1.0 g并用20 ml双蒸水混匀，以7 500 rpm 离心5 min，去上清液，同法清洗3 次后，用3.5 ml 无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）混匀清洗后样品，吸取350 μl；对于液体制剂样品，取2.0 ml，以7 500 rpm 离心5 min，去上清液；用20 ml 双蒸水混匀后，以7 500 rpm 离心5 min，去上清液，同法清洗3 次后，用350 μl无菌PBS 混匀。

DNA 抽提：使用基因组DNA 提取试剂盒，按说明书要求提取总DNA，并使用Nanodrop One 超微量核酸蛋白测定仪测定其核酸浓度。

2.2 冬虫夏草对照药材及中药材ITS 序列溯源分析

通过查阅文献，应用通用内转录间隔区（internally transcribed spacer，ITS）引物[9]扩增冬虫夏草标准物质、发酵冬虫夏草菌粉标准物质、亚香棒虫草、新疆虫草、古尼虫草、蛹虫草和虫草花的ITS 序列，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司对相关PCR 产物进行克隆测序，对于每个样品的PCR 产物挑取3 个克隆子进行测序，并通过NCBI 网站BLAST 对样品序列进行核酸比对溯源分析（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），以确定样品来源，引物序列见表1。

表1 ITS 通用引物序列

2.3 ddPCR 检测方法实施

选择引物与探针开展ddPCR 检测，引物及探针序列[7]见表2；调整退火温度、引物浓度和探针浓度，摸索ddPCR 反应条件，确定ddPCR 检测方法。其中，反应体系总体积为20 μl，包含ddPCRTMSupermix for Probes（No dUTP）10 μl，DNA 1 μl，5'端引物和3'端引物（20 μmol/L）各0.9 μl，探针（20 μmol/L）0.25 μl，用水补足至总体积20 μl。PCR 反应参数：95 ℃，10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃60 s，40 个循环；98 ℃，10 min。

表2 冬虫夏草引物及探针序列

2.4 ddPCR 检测方法特异性评估

采用ddPCR 方法检测冬虫夏草标准物质、发酵冬虫夏草菌粉标准物质、亚香棒虫草、新疆虫草、古尼虫草、蛹虫草和虫草花样品，评估ddPCR 检测方法的特异性。

2.5 质量与基因拷贝数换算公式确定

称取6 个质量梯度的发酵冬虫夏草菌粉标准物质（1、2、4、8、10、15 mg），记作ml；提取基因组DNA，使用Nanodrop One 超微量核酸蛋白测定仪测定DNA 含量，记作C1；每个梯度重复3 次，分析质量与DNA 含量的线性关系，计算相关系数R2。

将提取的发酵冬虫夏草菌粉的DNA 进行系列稀释后，分别以7 个DNA 质量浓度梯度（1、0.5、0.2、0.1、0.01、0.001、0.0001 ng/μl）进行ddPCR检测，分析DNA 含量与拷贝数的关系；每个梯度重复3 次，分析DNA 含量与拷贝数的线性关系，计算相关系数R2。

2.6 自制模拟混合样品检测

为验证ddPCR 检测方法的抗干扰性，以总质量为50 mg 的亚香棒虫草为掺伪品，称取8 个质量分数（10%、20%、30%、40%、50%、70%、90%、100%）的发酵冬虫夏草菌粉，不足含量添加亚香棒虫草，制成冬虫夏草掺伪品；每个质量分数称取10 mg，提取核酸DNA 后稀释200 倍，取1 μl 进行ddPCR检测及抗干扰实验，每个质量分数重复3 次。

2.7 市售样品检测

按2.3 方法实施对冬虫夏草标准物质及收集的市售西藏冬虫夏草、青海冬虫夏草、冬虫夏草粉、金水宝胶囊、百令片、虫草清肺胶囊、复方虫草养血颗粒、复方虫草口服液中的发酵冬虫夏草菌粉进行定量检测，验证ddPCR 检测方法的实际应用能力。

3 结果与分析

3.1 冬虫夏草对照药材及中药材ITS 序列的溯源分析结果

冬虫夏草及发酵冬虫夏草菌粉标准物质、冬虫夏草正品、西藏冬虫夏草、青海冬虫夏草及伪品亚香棒虫草、新疆虫草、古尼虫草、蛹虫草等的ITS基因PCR 产物克隆测序所得序列经溯源分析，确认样品来源与前期判断一致。

3.2 ddPCR 检测方法的特异性评估结果

对冬虫夏草及其伪品进行ddPCR 检测，评估其方法的特异性，结果显示，对于冬虫夏草和发酵冬虫夏草菌粉标准物质，分别检出冬虫夏草阳性微滴数12 712 个和12 956 个；对于蛹虫草、古尼虫草、新疆虫草、亚香棒虫草和虫草花，检出冬虫夏草阳性微滴数均为0，见图1，表明此方法对冬虫夏草菌具有良好的检测特异性。

图1 冬虫夏草及其常见伪品的ddPCR 检测结果

3.3 质量与基因拷贝数换算公式的确定结果

分析发酵冬虫夏草菌粉质量与DNA 浓度的关系，结果显示，当发酵冬虫夏草菌粉质量在1～15 mg 范围内时，两者成良好的线性关系，C1=7.4356m1+12.546，R2=0.9927，见图2。

图2 发酵冬虫夏草菌粉质量与DNA 浓度的关系

分析发酵冬虫夏草菌粉DNA 浓度与基因拷贝数的关系，结果显示，当发酵冬虫夏草菌粉DNA浓度在0.0001～1 ng/μl 范围内时，两者成良好的线性关系，y=11 526C1-46.701，R2=0.9991，见图3。

图3 发酵冬虫夏草菌粉DNA 浓度与基因拷贝数的关系

根据以上两个关系式，以DNA 浓度为中间换算量，可通过基因拷贝数计算得到发酵冬虫夏草菌粉质量。

3.4 自制模拟样品的检测结果

通过对自制模拟样品进行检测，结果显示，ddPCR 检测所得的发酵冬虫夏草菌粉实测含量在掺伪90%时偏差较大，在掺伪0%～70%范围时，与真实含量基本一致，见表3，表明此方法对冬虫夏草菌定量检测的准确性高，可用于冬虫夏草菌的定量检测。

表3 自制模拟样品中发酵冬虫夏草菌粉成分含量的检测结果

3.5 市售样品中冬虫夏草菌的定量检测结果

应用ddPCR 检测方法对冬虫夏草标准物质、市售西藏冬虫夏草、青海冬虫夏草、冬虫夏草粉、金水宝胶囊、百令片、虫草清肺胶囊、复方虫草养血颗粒、复方虫草口服液中的冬虫夏草菌进行定量检测，每种样品检测3 次，除冬虫夏草粉和金水宝胶囊未检出冬虫夏草菌外，其余产品均检出冬虫夏草菌，但虫草清肺胶囊、复方虫草养血颗粒和复方虫草口服液中冬虫夏草菌的含量均低于1%，见表4。

表4 市售样品中冬虫夏草菌成分的定量检测结果

4 讨论

冬虫夏草为虫菌结合体，成分复杂，其无性型鉴定在学术界仍存在争议，本研究依据《中国药典2020 年版（一部）》[1]，以冬虫夏草菌含量作为定量检测指标，探讨对冬虫夏草进行定量检测的可行性。

本研究提出的ddPCR 检测方法，特异性好，准确性高，通过此方法对市售样品进行检测，发现冬虫夏草标准物质、西藏冬虫夏草和青海冬虫夏草的冬虫夏草菌含量均超过100%，百令片作为冬虫夏草制剂检出7.6%的冬虫夏草菌含量，表明此方法可较好地鉴别冬虫夏草真伪，并可对其中的冬虫夏草菌含量进行定量检测；购买的冬虫夏草粉未检出相关成分，为伪品。本研究受方法学的限制，目前并未对冬虫夏草相关制剂进行含量控制，ddPCR检测方法检测的虫草清肺胶囊、复方虫草养血颗粒和复方虫草口服液均检出冬虫夏草菌，但实测含量低于1%，可能是由于制剂中含有较多添加剂，制备过程复杂，导致核酸提取不完全，也可能是由于冬虫夏草价格高昂，相关制剂中冬虫夏草添加量低。可进一步模拟制剂工艺过程，对不同冬虫夏草含量的模拟样品开展检测，深入探讨ddPCR 检测方法在不同制剂中定量检测冬虫夏草的可行性。

ddPCR 检测方法主要针对冬虫夏草菌开展冬虫夏草的定量检测，冬虫夏草菌成分稳定，可将其作为冬虫夏草含量的质控指标；但考虑到冬虫夏草是虫菌结合体，后续实验可考虑进一步结合虫体开展更全面的定量检测方法的探索。

总之，本研究以冬虫夏草菌含量为指标，提出了冬虫夏草的ddPCR 检测方法，不仅为冬虫夏草及其制剂的质量控制提供了新方法，而且为ddPCR在中药鉴伪中的应用提供了新思路。