林鑫,黄群

(1. 右江民族医学院研究生学院,广西 百色 533000;2. 右江民族医学院附属医院泌尿外科,广西 百色 533000)

膀胱癌(bladder cancer)是泌尿系统常见的恶性肿瘤,约75%的初诊患者为非肌层浸润性膀胱癌[1]。其中约50%的非肌层浸润性膀胱癌患者在接受经尿道膀胱肿瘤切除术后2年出现复发,40%的病例在5年后进展为肌层浸润性膀胱癌[2],而进展为浸润性膀胱癌后的5年生存率约为57%[3]。肌层浸润性膀胱癌的标准治疗为根治性膀胱切除同时行盆腔淋巴结清扫术,但50%的膀胱癌病例最终出现转移,且不同分子亚型的膀胱癌对各类治疗手段的敏感性也存在很大差异[4]。PD-1/PD-L1抑制剂是近年来膀胱癌免疫治疗的一次重大突破,显示出较好的效果及良好的安全性,虽然可以通过PD-1表达量、膀胱癌分型等预测免疫治疗效果,但仍有部分病人对PD-1/PD-L1抑制剂无反应[5]。针对晚期膀胱癌患者的治疗,仍需找到有效的治疗靶点,指导治疗方案的分子标志物。

Spectrin蛋白是细胞膜骨架的重要组成部分,由两个α亚基和两个β亚基形成丝状四聚体结构,在维持胞膜完整性、介导细胞黏附及迁移等方面发挥重要作用[6]。非红细胞血影蛋白β2(spectrin beta,non-erythrocytic 2,SPTBN2) 是Spectrin蛋白β-Ⅲ亚基的编码基因,定位于染色体11q13[7]。既往研究发现,SPTBN2在肺腺癌、子宫内膜癌等肿瘤中出现不同程度的差异性表达[8-9]。有研究认为SPTBN2蛋白免疫组化结果可以作为一种潜在的诊断恶性周围神经鞘瘤的高敏感性指标[10]。在结直肠癌中,SPTBN2出现高表达,与淋巴转移、远处转移密切相关[11]。SPTBN2已被证明在多种肿瘤细胞中出现差异性表达且影响预后,但其在膀胱癌中的作用机制尚不明确,在膀胱癌细胞中的生物学作用目前国内外少有报道。本研究旨在探讨SPTBN2基因对膀胱癌5637细胞增殖、迁移和侵袭的作用,为研究膀胱癌发生发展和转移机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要材料 人类膀胱癌细胞5637(武汉普诺塞生命科技有限公司);RPIM-1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素(美国gibco公司);siRNA、引物合成(苏州吉玛生物科技有限公司);Lipofectamine 2000、TRIzol试剂、逆转录试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司);Matrigel基质胶、Transwell小室(美国Coring公司);SYBR Green PCR Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司);CCK-8试剂盒(上海同仁生物科技有限公司);SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、7.5 % PAGE凝胶快速制备盒、RIPA强效裂解液、ECL化学发光试剂盒(上海雅酶生物医药科技有限公司);PVDF膜(美国Millipore公司);SPTBN2多克隆抗体、GAPDH多克隆抗体、HRP标记羊抗兔二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)。

1.2主要设备与仪器 生物安全柜、CO2恒温培养箱、离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司);LightCycle 96荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司);多功能酶标仪(美国Perkin Elmer公司);电泳转移槽(美国BIO-RAD公司);AI600 化学发光成像仪(美国GE公司);倒置光学显微镜(德国Laica公司);超微量紫外分光光度计(北京天根生化科技有限公司)。

1.3细胞培养与转染 将人类膀胱癌5637细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI1640培养基中,在37 ℃、 5% CO2条件下培养,胰蛋白酶常规消化细胞以传代,选择对数生长期细胞进行下一步实验。实验分为空白对照组(blank control group,Blank组)、阴性对照组(negative control,NC组)、siRNA实验组(siRNA#1组、siRNA#2组)。转染前24 h,常规消化细胞,用完全培养基重悬细胞后进行细胞计数,于6孔板中每孔接种3×105个细胞,待细胞密度至50%～70%时进行转染。250 μL基础培养基分别稀释5 μL Lipofectamine 2000转染试剂与5 μL siRNA,混合孵育20 min后加入至6孔板中,转染体系总计为2 mL,阴性对照组转染通用阴性序列siRNA,空白对照组中加入等量转染试剂,转染6 h后更换新鲜培养基。

1.4实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qPCR) 转染24 h后,用TRIzol法提取细胞总RNA,超微量紫外分光光度计测量总RNA浓度,取1 μg总RNA进行逆转录合成cDNA,配制SYBR Green PCR Master Mix体系进行实时荧光定量PCR,反应条件为:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,62 ℃ 60 s,共计40个循环。以GAPDH为内参,采用2-△△Ct法处理数据,对相对表达量进行分析,进行3次以上重复实验。SPTBN2上游引物:GCCCGCAACCTGCATACTAA,下游引物:AGCTCTCGCCCTTCCTTGTC,GAPDH上游引物:ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG,下游引物:GCCATCACGCCACAGTTTC。

1.5蛋白免疫印迹 (Western Blot) 转染48 h后用RIPA强效裂解液提取细胞总蛋白,BCA法进行蛋白定量,加入足量SDS-PAGE蛋白上样缓冲液后煮沸10 min。每孔蛋白上样量为30 μg。7.5% SDS-PAGE胶电泳分离蛋白,SPTBN2蛋白转膜条件为恒流300 mA转膜4 h,将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭2 h,用TBST清洗3次,每次5 min。各个条带分别加入SPTBN2一抗(1∶3000)和GAPDH一抗(1∶5000),4 ℃摇床孵育过夜,用TBST清洗后加入二抗(1∶10000)孵育1 h,使用ECL试剂显影,以GAPDH为内参使用ImageJ软件对结果进行分析。

1.6CCK-8增殖实验 转染后以胰蛋白酶常规消化细胞,用完全培养基重悬细胞,将细胞接种于96孔板中,细胞接种密度为2 000个/孔,每组设5个复孔,分别于细胞贴壁后0 h、24 h、48 h、72 h加入CCK-8试剂,37 ℃孵育2 h后使用酶标仪测量450 nm波长吸光度(OD值)。

1.7划痕实验 6孔板底部做3条平行横线,以每孔4×105个细胞的密度接种于6孔板中,转染后常规培养48 h至细胞铺满,用200 μL枪头垂直于孔板表面画下划痕,吸出培养基后以PBS缓冲液清洗两遍,加入含2%胎牛血清的培养基,取5个视野于倒置显微镜下拍照,并于24 h后再次拍照记录,使用ImageJ软件分析,计算划痕愈合率,划痕愈合率=(初始划痕宽度值-对应时间点划痕宽度值)/初始划痕宽度值。

1.8Transwell侵袭实验 Matrigel基质胶中加入新鲜培养基稀释至500 mg/mL,每个Transwell小室中分别加入100 μL基质胶,置于37 ℃培养箱中3 h,细胞转染后常规消化,使用无血清培养基重悬细胞调整细胞浓度至5×105/mL,每个小室上层加入100 μL细胞悬液,在下室内加入500 μL含10%胎牛血清的培养基,继续培养48 h后用4%多聚甲醛固定15 min,用棉签轻轻拭去上室中的基质胶,结晶紫染色15 min后,用PBS清洗两遍,于倒置显微镜下拍照,使用Image J软件计算透过滤膜的细胞数。

2 结果

2.1构建SPTBN2低表达细胞株 实时荧光定量PCR结果显示,转染SPTBN2 siRNA的5637膀胱癌细胞中SPTBN2 mRNA表达水平较空白对照组和阴性对照组降低(见图1),差异具有统计学意义(P<0.001)。空白对照组和阴性对照组间无统计学差异(P>0.05)。Western Blot结果显示,实验组的SPTBN2蛋白表达量明显低于对照组(见图2),差异具有统计学意义(P<0.01),空白对照组和阴性对照组间无统计学差异(P>0.05)。

2.2敲低SPTBN2抑制膀胱癌5637细胞的增殖 CCK-8实验结果显示,48 h起,实验组的OD值低于阴性对照组(P<0.001),72 h各组细胞的OD值低于阴性对照组(见图3),差异具有统计学意义(P<0.05)。

注:与Blank组相比,**P<0.01。

图3 CCK-8法检测细胞增殖的结果

表1 CCK-8法检测细胞增殖的结果

2.3SPTBN2对膀胱癌迁移、侵袭能力的影响 经过siRNA处理的两组细胞,24 h的迁移率低于阴性对照组(见图4),差异具有统计学意义(P<0.001)。Transwell侵袭实验显示,实验组细胞穿透至下室的数量较阴性对照组明显减少(见图5),差异具有统计学意义(P<0.001)。

图4 划痕实验结果(×40)

表2 划痕实验愈合百分比

图5 Transwell侵袭实验结果(×100)

3 讨论

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,患者的不良预后与肿瘤侵袭深度、淋巴结转移、远处转移和化疗耐药相关,因此,有必要了解膀胱癌发展的分子机制和寻找有效的肿瘤标志物,以开发新的治疗靶点[12]。肿瘤组织中SPTBN2高表达提示预后不良,这在肺腺癌、子宫内膜癌等多种癌症中均有报道。本研究发现,在人类膀胱癌5637细胞中沉默SPTBN2的表达能抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,提示SPTBN2对膀胱癌的发展具有重要作用。

表3 Transwell实验侵袭细胞数

SPTBN2是Spectrin蛋白β-Ⅲ亚基的编码基因,定位于染色体11q13,SPTBN2参与维持细胞正常形态和功能,同时还是细胞高尔基体膜的主要组成部分[7]。SALCEDO-SICILIA L等[13]研究发现,SPTBN2在维持高尔基体膜结构完整性和调控蛋白分泌中发挥重要作用,SPTBN2编码的蛋白主要富集于高尔基体的远端膜囊,维持高尔基体结构完整性和分泌活性,完全去除SPTBN2可导致高尔基体裂解。此外,SPTBN2还参与细胞信号通路的传导,SPTBN2可通过稳定细胞膜表面兴奋性氨基酸转运体4(excitatory amino acid transporter 4, EAAT4)以调控谷氨酸信号通路[14]。在小鼠模型中,SPTBN2缺失能引起浦肯野细胞中钠离子电流减少及谷氨酸信号通路发生改变[15]。针对SPTBN2与疾病的研究主要集中在神经退行性疾病如脊髓小脑性共济失调、认知障碍等方面[16]。SPTBN2蛋白可与肌动蛋白丝结合,形成SPTBN2收缩蛋白-肌动蛋白骨架,SPTBN2基因突变促使SPTBN2蛋白与肌动蛋白丝亲和力增加而导致5型脊髓小脑性共济失调[17]。近年来的研究发现,在肺腺癌中,SPTBN2表达量与肺癌患者预后显著相关, SPTBN2可促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[8]。在结直肠癌中,SPTBN2可通过m6A修饰促进翻译从而促使肿瘤恶性转化[11]。甲状腺癌细胞敲低SPTBN2后,甲状腺癌细胞株的增殖、迁移能力和细胞周期G1/S期转化被抑制,凋亡细胞比例增加,同时细胞周期抑制蛋白P21,cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3、Bax等凋亡相关蛋白表达增加,说明SPTBN2在甲状腺癌细胞中可能参与细胞周期转换,抑制肿瘤细胞凋亡[18]。在子宫内膜癌中,SPTBN2是miR-424-5p的下游靶基因,SPTBN2可以与Claudin-4(CLDN4)相互作用,通过PI3K/AKT通路促进子宫内膜癌转移[9]。以上研究表明,SPTBN2参与多方面生物学过程,在多种肿瘤发生发展中发挥重要作用,具有较高研究价值。

膀胱癌早期临床症状不明显,导致部分患者首诊时肿瘤可能已发展至中晚期,且易复发的特点要求患者需要长期、规范的检查,这也增加了患者的治疗成本和心理负担。膀胱癌的生物学性质复杂,目前对其发病机制、进展过程仍未完全了解。因此,对膀胱癌发生、转移机制的研究,为寻找新的肿瘤标志物和预后评估具有重要意义。前期生物信息学研究结果表明SPTBN2显著影响膀胱癌患者预后,可能与膀胱癌的发展相关[19],但SPTBN2在膀胱癌细胞中的相关作用尚未被深入研究。为进一步探讨SPTBN2在膀胱癌细胞中的作用,验证SPTBN2对膀胱癌细胞的影响,本研究设计了两条靶向SPTBN2 siRNA序列,通过RNA干扰技术构建SPTBN2低表达细胞株,qPCR和Western Blot结果显示,两条siRNA序列具有较好的干扰效率。CCK-8增殖实验结果表明,两组经过转染靶向SPTBN2 siRNA的细胞,48 h和72 h的增殖速率均低于阴性对照组,SPTBN2 siRNA实验组的增殖活性受到抑制;划痕实验和Transwell实验显示,下调SPTBN2表达后,膀胱癌5637细胞的迁移和侵袭能力较对照组弱。实验发现减少膀胱癌5 637细胞中SPTBN2的表达量能抑制肿瘤增殖、迁移和侵袭,提示SPTBN2在膀胱癌发展中发挥促进作用,本研究的结果与既往研究结果相一致[19]。

近年来,膀胱癌手术技术的改进以及新型治疗方案的应用,改善了部分患者的预后情况,但膀胱癌具有高度异质性,对各种治疗手段的敏感性存在很大差异,总体上膀胱癌患者的长期生存率仍变化不大[20]。针对膀胱癌的部分靶向药物显示出较好的治疗效果和应用前景[21]。但仍有部分患者不能从治疗中获益,现有的靶向药物在临床应用中仍具有局限性。如何减少肿瘤复发和进展仍然是膀胱癌治疗中有待突破的难点。SPTBN2分布于多种细胞,在膀胱癌、甲状腺癌、结直肠癌等肿瘤发展过程中发挥促进作用,高表达SPTBN2提示肿瘤患者的预后较差,SPTBN2的靶向药物研究可能成为未来膀胱癌治疗药物研发的方向。本研究验证了两条靶向SPTBN2 siRNA的有效性,实验结果显示,SPTBN2是促进膀胱癌肿瘤细胞增殖和侵袭的因子,降低SPTBN2的表达能有效抑制膀胱癌5637细胞的恶性生物学行为。因此SPTBN2可能是肿瘤治疗的潜在靶点,针对SPTBN2的进一步研究,对指导膀胱癌患者的临床治疗,研究新的治疗靶点具有重要意义。

本研究观察到SPTBN2的表达与膀胱癌5637细胞的增殖、迁移和侵袭能力相关,但作用机制尚不清楚,下调SPTBN2是否影响细胞内增殖与侵袭有关蛋白的表达以及细胞DNA复制活性能否受到抑制,有待进一步研究。

综上所述,研究发现降低SPTBN2在膀胱癌5637细胞中的表达能抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。这提示SPTBN2在膀胱癌诊断和治疗中具有重要意义,值得深入研究。