樊馨竹，沈艺琳，许涛，罗驰恒，高羽亭（1.广东医科大学公共卫生学院，广东东莞 523808；2.东莞市环境医学重点实验室，广东东莞 523808；3.东莞市环境与健康研究所，广东东莞 523808）

癌症是全球人口死亡的主要原因之一[1]，且尚未发现治愈的方法[2]。随着生物信息学方法和一些公共数据库的不断发展和改进，可以通过对基因进行泛癌分析来评估其与临床预后和免疫细胞浸润的相关性，以寻求新的治疗靶点[3-4]。Wnt 蛋白家族能够以旁分泌和自分泌方式激活细胞膜受体，是Wnt 信号通路的主要组成部分[5]。该信号通路参与细胞的生长、增殖等生物学过程，与肿瘤等多种人类疾病高度相关[6]。WNT2B 是刺激经典Wnt 通路的Wnt 配体之一[7]，在许多生理和病理过程，特别是在肿瘤的发展中起着至关重要的作用[8-9]。在泛癌水平上对WNT2B 的功能和临床重要性进行全面分析研究鲜见，据此，本文针对该基因进行了泛癌分析，以探讨WNT2B 在癌症进展中的作用。

1 材料和方法

1.1 WNT2B 基因表达分析

本文从UCSC 数据库中下载癌症基因组图谱（TCGA）泛癌数据集，从中提取ENSG00000134245（WNT2B）基因在各个样本中的表达数据，分析该基因在各个肿瘤样本中瘤与瘤旁的差异。考虑到TCGA中正常样本较少，本研究从UCSC 数据库中下载TCGA TARGET 基因型-组织表达（GTEx）泛癌数据集，整合GTEx 数据库中的正常组织的数据和TCGA 中肿瘤组织的数据分析各种肿瘤的表达差异。

1.2 基因表达预后分析

本文从先前发表在《Cell》上的TCGA 预后研究[10]中获得高质量的TCGA 的预后数据集，从UCSC 的癌症浏览器中获取TARGET 随访数据作为补充，使用R软件包survival 的coxph 函数建立Cox 比例风险回归模型以分析基因表达与每个肿瘤中的预后关系得到森林图，然后将患者分为高低两组，用R 软件包survival 的survfit 函数分析两组的预后差异得到KM 生存曲线。

1.3 免疫浸润分析

利用TIMER 数据库分析WNT2B 表达与癌症相关成纤维细胞浸润之间的相关性。从TIMER 数据库下载了33 种癌症的6 种免疫浸润细胞的得分数据，分析基因表达与这些免疫细胞得分的相关性。利用R软件包ESTIMATE[11]分析各个肿瘤样本的基质评分（Stromal score），免疫评分（Immune score）和综合评分（ESTIMATE score）。

1.4 基因突变与表达分析

从GDC 上下载了经GISTIC 软件[12]处理的所有TCGA 样本的拷贝数变异（CNV）数据集，整合样本的拷贝数数据和基因表达数据，使用R 软件计算每个肿瘤中基因在基因组变异和非变异样本中的表达差异。

1.5 基因组异质性与基因表达分析

从先前的研究[13]中获取每个肿瘤的免疫新抗原数据，计算在各个肿瘤中新抗原和WNT2B 表达的相关性。从GDC 上下载经MuTect2 软件[14]处理的所有TCGA 样本的单核苷酸变异数据集，利用R 软件包maftools 的tmb 函数计算每个肿瘤的TMB，并整合样本的TMB 评分和WNT2B 表达数据，计算他们之间的相关性。且从先前的研究[15]中获取每个肿瘤的MSI 评分，整合样本的MSI 评分和基因表达数据，在每种肿瘤中计算他们之间的相关性。

1.6 统计学处理

癌症基因表达谱数据均通过log2（x+0.001）转化进行标准化。使用非配对的秩和检验和秩和检验进行两两之间的差异显著性分析，利用kruskal.test 进行多组样本的差异检验。使用单因素Cox 回归模型、卡普兰—迈尔方法进行生存分析，并利用logrank test 方法评估不同组样本之间的预后差异显著性。使用斯皮尔曼或皮尔森相关系数来进行相关性分析。

2 结果

2.1 WNT2B 在泛癌中的表达水平

分析WNT2B 在TCGA 泛癌数据中的mRNA 表达水平，结果显示，WNT2B 在头颈鳞状细胞癌（HNSC）、肾乳头状细胞癌（KIRP）、肾透明细胞癌（KIRC）、胆管癌（CHOL）、混合肾癌（KIPAN）、肝细胞肝癌（LIHC）和肺鳞癌（LUSC）这7 种肿瘤中高表达，在多形成性胶质细胞瘤（GBM）、胶质瘤（GBMLGG）、子宫内膜癌（UCEC）、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（PCPG）、膀胱尿路上皮癌（BLCA）、肾嫌色细胞癌（KICH）、甲状腺癌（THCA）、直肠腺癌（READ）、脑低级别胶质瘤（LGG）、肺腺癌（LUAD）、乳腺浸润癌（BRCA）、前列腺癌（PRAD）、结肠癌（COAD）及结直肠癌（COADREAD）这14 种肿瘤中低表达，见图1A。

本文整合GTEx 数据库中的正常组织的数据和TCGA 中肿瘤组织的数据，结果显示WNT2B 在KIRP、KIPAN、HNSC、KIRC、胰腺癌（PAAD）、睾丸癌（TGCT）、白血病（ALL）、急性髓细胞样白血病（LAML）和CHOL 这9 种肿瘤中高表达，而在25 种肿瘤中表达较低，除上述14 种肿瘤类型外，还有宫颈鳞癌和腺癌（CESC）、肾母细胞瘤（WT）、黑色素瘤（SKCM）、卵巢浆液性囊腺癌（OV）、食管癌（ESCA）、子宫肉瘤（UCS）、肾上腺皮质癌（ACC）、胃和食管癌（STES）、胃癌（STAD）、LUSC 和 LIHC，见图1B。

图1 WNT2B 在泛癌中的表达分析

2.2 WNT2B 在泛癌中的预后意义

Kaplan-Meier 分析显示WNT2B 高表达的患者在TCGA-LGG、TARGET-LAML、TCGA-BLCA、TCGA-LAML 中总生存时间较短，在TCGA-LUSC、TARGET-ALL 中总生存时间较长（图2A～F）。

图2 WNT2B 表达与不同肿瘤患者总生存期的相关性

单变量Cox 回归分析显示，WNT2B 高表达是TCGA-LGG、TARGET-LAML、TCGA-BLCA 和TCGA-LAML 患者总生存期（OS）的危险因素，是TCGA-LUSC 和TARGET-ALL 患者的保护因素（图3A）。此外，疾病特异性生存期（DSS）分析显示，WNT2B 是TCGA-LGG，TCGA-BLCA 患者的危险因素，是TCGA-LUSC 患者的保护因素（图3B）。无病生存期（DFI）分析显示，WNT2B 是TCGA-ACC 患者的危险因素，是TCGA-UCEC 患者的保护因素（图3C）。最后，无进展生存期（PFI）分析表明，WNT2B是TCGA-LGG、TCGA-BLCA、TCGA-ACC 患者的危险因素，是TCGA-THYM、TCGA-PAAD 患者的保护因素（图3D）。

2.3 WNT2B 表达与免疫细胞浸润水平的关系

结果显示WNT2B 表达与LIHC、PRAD、STAD 和THYM 呈正相关（P<0.05）。WNT2B 表达与6 种常见的免疫细胞得分也具有一定的相关性，其中最显著相关的3 个肿瘤是COAD、KIRC、LGG（图4）。在分析肿瘤样本中WNT2B 表达与Immune Score、Stromal Score 和ESTIMATE Score 的关系，图中分别显示了最显著相关的3 个肿瘤（图5）。

图4 WNT2B 表达与免疫细胞浸润水平的相关性分析

图5 WNT2B 与Immune Score、Stromal Score 和ESTIMATE Score 的相关性分析

2.4 WNT2B 表达与基因突变有关

整合了样本的拷贝数数据和WNT2B 表达数据，以探索每个肿瘤中基因组变异和非变异样品中基因表达的差异。结果显示ESCA、STES、STAD、PRAD、LUSC、PAAD、OV、SKCM 和BLCA 这9 种肿瘤中差异有统计学意义，如图6。

图6 WNT2B 表达与基因突变的相关性（*P<0.05，**P<0.01）

2.5 WNT2B 表达与基因组异质性的关系

结果显示在3 种肿瘤中WNT2B 的表达与TMB显著相关，其中在THCA 及ACC 中呈正相关，在ROADREAD 中呈负相关（图7A）。在8 种肿瘤中发现WNT2B 与TMB 显著的相关性。在KIPAN、ACC等2 种肿瘤中呈显著正相关，在COADREAD、STES、STAD、PRAD、LUSC 与CHOL 等6 种肿瘤中呈显著负相关（图7B）。在13 种肿瘤中发现WNT2B 与MSI也存在显著的相关性，其中在4 种肿瘤中呈显著正相关，如GBMLGG、LGG、LUAD、LUSC，在9 种肿瘤中显著负相关，如COAD、COADREAD、STES、KIPAN、STAD、UCEC、HNSC、SKCM 及DLBC（图7C）。

图7 WNT2B 表达与基因组异质性的关系

3 讨论

Wnt 信号通路是重要的信号通路之一，WNT2B作为经典通路分子，在癌症进展中发挥重要的作用。已有研究证实，通过靶向WNT2B 可以抑制胆囊癌和胆管癌细胞的增殖，迁移和侵袭[16]，以及延缓胶质母细胞瘤的癌变[17]。沉默WNT2B 能够增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性[18]。然而，目前尚无针对WNT2B 的泛癌研究。因此在本项研究中，本文整合GTEx 和TCGA 数据，详细分析WNT2B 在泛癌中的表达水平、预后状态、免疫浸润和遗传改变等特征，旨探讨WNT2B 与肿瘤免疫浸润的相关性及其在泛癌中潜在的预后价值，以寻求新的治疗靶点。

本文发现WNT2B 在泛癌中的表达存在显著差异。与正常组织相比，WNT2B 在KIRP、KIPAN、HNSC、KIRC、PAAD、TGCT、ALL、LAML 和CHOL中是高表达的，而在GBM、GBMLGG、LGG、LUAD、COAD、COADREAD、BRCA、PRAD、UCEC、THCA、READ、PCPG、BLCA、KICH、CESC、ESCA、STES、STAD、LUSC、LIHC、WT、SKCM、OV、UCS 和ACC 中则表达较低。研究表明，在化疗组中高表达Wnt2B 的AML 患者预后更差[19]。此外，Wnt2B 在人胰腺癌组织中的表达显著高于正常胰腺组织，且与较低表达组相比，癌症组织中Wnt2B 表达升高预示着总生存期更短，提示Wnt2B 的高表达可能与癌症患者预后不良有关[20]。在本研究中发现，高表达的患者在TCGA-LGG、TARGET-LAML、TCGABLCA 和TCGA-LAML 中总生存时间较短，而在TCGA-LUSC，TARGET-ALL 中总生存时间较长，表明WNT2B 的表达会对不同癌症患者的预后造成不同的影响，体现WNT2B 在泛癌中的预后价值，显示其可作为一种预后生物标志物的潜力。

肿瘤微环境（TME）是规范和非规范Wnt 配体的来源，可以诱导癌细胞和免疫细胞中的信号通路发生异常[21]。在TME 中，CAFs 已被证实在肿瘤的发展中起着多种作用[22]。肿瘤免疫微环境与各种基因的表达水平有关。在本研究中发现WNT2B 的表达与多种肿瘤的CAFs 浸润呈正相关，且在LIHC、PRAD、STAD和THYM 中尤为显著。此外，WNT2B 的表达与COAD、KIRC 和LGG 中6 种类型的免疫细胞浸润显著相关，并与一些肿瘤的Immune Score、Stromal Score和ESTIMATE Score 相关。以上结果均显示了在不同肿瘤中免疫细胞的浸润状态，提示WNT2B 的表达可以参与调节免疫细胞浸润到肿瘤组织中这一过程，表明WNT2B 在调节癌症肿瘤免疫学中发挥了一定的作用。

肿瘤新抗原是肿瘤免疫治疗的新兴方法之一，主要是由肿瘤细胞突变产生的肿瘤特异性抗原，仅在肿瘤细胞中大量表达，具有很强的免疫原性和肿瘤异质性[23]。用新抗原合成的疫苗具有多靶点，安全，广谱等优点，它不易引起中枢耐受和自身免疫反应，可用于为癌症患者准备个性化疫苗[24]。利用肿瘤新抗原的免疫活性，可以根据肿瘤细胞突变的情况设计合成新抗原疫苗，对患者进行免疫注射，达到个体化治疗的效果。TMB 是肿瘤标本中存在的突变总数，可作为一种生物标志物预测多种癌症类型免疫治疗后的生存 率[25]。MSI 是指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现新的微卫星等位基因的现象。近年来的研究提示MSI 有可能成为评估肿瘤恶性程度，疗效和预后的关键预测因子。在本研究结果中可看出WNT2B 的表达在THCA、ACC 和COADREAD 中与肿瘤新抗原相关，在KIPAN、ACC、COADREAD、STES、STAD、PRAD、LUSC 和CHOL 中与TMB 相关，在GBMLGG、LGG、LUAD、LUSC、COAD、COADREAD、STES、KIPAN、STAD、UCEC、HNSC、SKCM 和DLBC 中与MSI 有关，表明WNT2B 表达水平会影响癌症的肿瘤新抗原，TMB 和MSI。

综上所述，我们应用综合生物信息学方法，表明WNT2B 表达可能介导免疫浸润并影响泛癌患者的预后，展示其作为预后生物标志物的潜力，并为临床癌症治疗提供新的靶点。