叶吉明,杨景然,刘宇,安宁,柏永强,陈文君

哮喘属中医学“哮证”“喘证”的范畴。《内经》认为,哮喘主要是肺病变引起,“伏痰”遇感引触,痰气交结,肺气宣降失常,而致痰鸣气喘。发作期以邪实为主,与肺脾肾三脏关系密切[1]。目前中医药治疗哮喘的研究取得了很大进展,治疗支气管哮喘由缓解支气管痉挛转向控制炎性反应,在临床发挥中医整体辨证施治的优势[2-3]。益气补肺膏系云南省第一人民医院临床有效经验方研制而成的中药复方制剂,膏中黄芪、法半夏和麻黄为君药,南沙参、白术、茯苓、陈皮等为臣药,干姜和大枣为佐药,炙甘草为使药,明确君药、臣药、佐药和使药并对其进行质量控制,对保证药效至关重要。本研究以方剂中麻黄为主要质控指标,对制剂中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱进行高效液相色谱法测定[4-8],旨在建立益气补肺膏的质量控制方法和标准。

1 材料与方法

1.1 仪器 LC-2030plus液相色谱仪(日本岛津有限公司),Polar-Phenyl色谱柱(5 μm,120 A,250 mm×4.6 mm,苏州赛分科技有限公司),CPA225D型电子天平(赛多利斯),KQ-500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),薄层自动铺板器(重庆南岸新力实验电器厂),定量毛细管(美国Drummond公司)。

1.2 试药及试剂 盐酸麻黄碱对照品(批号:171241-201809);盐酸伪麻黄碱对照品(批号:171237-201510),均为中国食品药品检定研究院提供。乙腈(色谱纯,Sigma公司),盐酸、乙醚和三乙胺(分析纯,天津市风船化学试剂有限公司),实验用水为蒸馏水;其他试剂均为分析纯。供试品(样品):益气补肺膏(云南省第一人民医院制剂,批号:20190221、20190227和20190228,规格:150 g/瓶)。样品含黄芪、南沙参、麻黄等。本品每1 g含麻黄以盐酸麻黄碱(C10H5NO·HCl)和盐酸伪麻黄碱(C10H5NO·HCl)的总量计,不少于0.1 mg。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Polar-Phenyl色谱柱(5 μm,120 A,250 mm×4.6 mm),流动相:乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)(3∶97),流速:1.0 ml/min,检测波长:210 nm,柱温:30 ℃。

2.2 制备对照品溶液 取对照品盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱,精密称定,加入稀乙醇溶液,随后制备成每1 ml含60 μg、30 μg的对照品溶液,备用。

2.3 制备供试品溶液 取供试品益气补肺膏(批号:20190221)约5 g,精密称定,置于带玻璃塞的锥形瓶中,加0.1%的盐酸溶液50 ml,称定重量,超声处理(功率240 W,频率45 kHz)30 min,放冷,用0.1%的盐酸溶液补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25 ml,滴加氨水(《中国药典》2015版附录要求)调pH值至11～12,用乙醚振摇提取3次,每次30 ml,合并乙醚液,加2 ml稀盐酸,水浴80 ℃蒸干,残渣用流动相溶解置于10 ml容量瓶中,加流动相至刻度,摇匀,滤过,作为供试品溶液,备用。

2.4 制备阴性对照品溶液 按处方比例,称取不含麻黄的阴性对照样品,加水煎煮3次,每次2 h,浓缩成浸膏,按照制备处方工艺加入比例的辅料,混匀。按“2.3”项制成不含盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的阴性对照品溶液,备用。

2.5 系统适用性试验[9]精密吸取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品、益气补肺膏供试品和阴性对照品溶液各10 μl,按“2.1”项的色谱条件,自动进样于高效液相色谱中,分析、记录色谱图,见图1-5。阴性对照品色谱图与对照品、混合对照品、供试品色谱图中相应的保留时间处无色谱峰出现,表明阴性对照品无干扰,方法专属性好。

2.6 考察线性范围 精密吸取“2.2”项盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品溶液1、5、10、15、20、25 μl,自动进样于高效液相色谱中,测其峰面积。以峰面积积分值为纵坐标,盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品的进样量为横坐标,进行线性回归,回归方程:盐酸麻黄碱Y=2287169.849X-19746.09355,R2=0.9998,盐酸伪麻黄碱Y=2233878.861X-6498.427419,R2=0.9998,表明,盐酸麻黄碱在0.05944～1.486 μg,盐酸伪麻黄碱在0.03116～0.779 μg范围内呈良好的线性关系。

图2 伪麻黄碱对照品溶液色谱图

图3 混合对照溶液色谱图

图4 供试品溶液色谱图

图5 阴性对照品溶液色谱图

2.7 精密度试验 精密吸取“2.2”项盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品溶液10 μl,自动进样于高效液相色谱中,连续进样6次,记录峰面积,盐酸麻黄碱峰面积RSD为0.07%,盐酸伪麻黄碱峰面积RSD为0.14%,结果表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验 称取同一批次益气补肺膏(批号:20190221)6份,按“2.3”项供试品溶液制备方法平行制备,精密吸取各10 μl,自动进样于高效液相色谱中,盐酸麻黄碱峰面积RSD为1.97%,盐酸伪麻黄碱峰面积RSD为1.72%,结果表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验 取“2.3”项益气补肺膏供试品溶液(批号:20190221),于室温下存放,分别于0、2、4、6、8、12、18、24 h精密吸取供试品溶液10 μl,自动进样于高效液相色谱中,盐酸麻黄碱峰面积RSD为0.23%,盐酸伪麻黄碱峰面积RSD为0.35%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.10 加样回收试验[10]称取同一批次益气补肺膏(批号:20190221;盐酸麻黄碱含量0.25 mg/g;盐酸伪麻黄碱含量0.13 mg/g)约2.5 g,精密称取6份,置于带玻璃塞的锥形瓶中。分别精密加入盐酸麻黄碱对照品溶液(浓度0.5944 mg/ml)0.8、1.0、1.2 ml,盐酸伪麻黄碱对照品溶液(浓度0.3116 mg/ml)0.8、1.0、1.2 ml,按“2.3”项制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件测定,盐酸麻黄碱回收率为90.2%、RSD为1.93%,盐酸伪麻黄碱回收率为86.4%、RSD为0.67%。表明该法回收率好,满足回收率限度85%～110%的要求,见表1-2。

表1 盐酸麻黄碱的加样回收试验 (n=6)

表2 盐酸伪麻黄碱的加样回收试验 (n=6)

2.11 样品含量测定 取3批益气补肺膏(批号:20190221、20190227和20190228)2.5 g,每批取2份,精密称取6份,按“2.3”项进行制备,精密吸取各10 μl,注入高效液相色谱仪,进行含量测定,见表3。根据3批中试样品麻黄中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱总含量为2.89%,由于药材随产地、批次不同,其含量略有差异,依据麻黄药材盐酸麻黄碱和盐酸麻黄碱总量限度为不得少0.80%投料计算,制得成品的总含量为0.1 mg/g。考虑到提取过程中偏差,故本品的含量限度定为每克含麻黄以盐酸麻黄碱(C10H5NO·HCl)和盐酸伪麻黄碱(C10H5NO·HCl)的总量计,不少于0.1 mg。

表3 3批样品含量测定

3 讨 论

现代医学角度认为,麻黄先煮可降低挥发油成分。研究发现,麻黄碱是麻黄发汗的主要成分,而麻黄中的麻黄碱大剂量使用会引起失眠不安、震颤等不良反应。麻黄碱属芳香胺类衍生物,常压条件下有挥发性,易随水蒸气挥发,故麻黄煎煮时间长可降低麻黄碱含量[11]。盐酸麻黄碱可治疗支气管哮喘和咳嗽等病症,静脉注射盐酸麻黄碱主要治疗低血压,剂量范围为0.7～1.0 mg/kg,口服剂量达到20 mg以上可能会产生心动过速和心悸等不良反应。盐酸麻黄碱在生物体内过量表现为类似甲基苯丙胺的性质,可引起神经紧张、心跳加速、高血压和癫痫。但现阶段的研究中未对中药制剂麻黄中的麻黄碱检测设定上限和下限范围,在用药过程中是否存在一定的潜在使用风险,应引起业界的重点关注。

流动相的优化,对甲醇、乙腈与不同浓度的磷酸溶液进行了考察,结果表明,酸的种类、浓度对盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的峰形影响大,最终确定了乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)(3∶97)为流动相进行洗脱时,峰形好,保留时间适宜。提取方式的优化,采用超声处理(功率240 W,频率45 kHz)和回流提取各30 min同时测定盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱两种成分的含量,在甲醇40.0 ml条件下对两种成分的提取效果较好,而提取方式对两种成分含量无较大影响,盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱含量测定分别为0.21 mg/g、0.10 mg/g,结果一致,故选超声处理进行提取。提取时间的优化,采用超声处理(功率240 W,频率45 kHz)分别提取30、60、90 min后,盐酸麻黄碱含量在0.24～0.25 mg/g、盐酸伪麻黄碱含量在0.12～0.13 mg/g,其结果表明提取时间不同30、60、90 min,但提取效果一致,故确定超声提取时间为30 min。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突。