刘小琳，魏丽婷，黄瑶雁，陈婉明，陈莎莎

（闽南科技学院生命科学与化学学院，福建泉州 362332）

中药厚朴是取自木兰科植物厚朴或凹叶厚朴经干燥后的干皮、根皮及枝皮。其药性温和、味苦且辛，无毒，归脾、胃、肺、大肠经。其功能为燥湿消痰，下气除满；主治痰饮喘咳，食积气滞，脘痞吐泻等[1]。厚朴在临床上配方的中成药高达200 种[2]，在我国已经有2 00 多年的药用历史。据文献报道[3-4]可知，其主要含有苯丙素、木脂素、小分子酚醛酯、苷类化合物、挥发油、生物碱、黄酮类及其他化合物，在四川、湖北、湖南、浙江、安徽、福建等省均有种植。现代药理研究表明，厚朴具有广谱抗菌、抗氧化、抗炎、抗溃疡、抗肿瘤、抗凝血、保护心脑血管等作用[5-6]。

超声波能产生强烈的空化效应、机械振动和高的加速度，进而产生巨大的压力、增大分子运动的频率和速度，不仅加速了药物中有效成分进入溶剂，也加强了细胞内产物的释放、扩散及溶解，从而提高提取的效率，具有耗时短、提取率高、溶媒用量小等优点[7]，广泛应用于化学工业、食品学、生物学、生态学、医学、制药等领域[8-10]。利用超声波辅助乙醇浸提法提取厚朴总黄酮，以芦丁作为对照品，采用比色法，绘制出标准曲线，并以总黄酮的提取量为指标，在单因素试验的基础上，采用响应面分析法（RSM） 优化总黄酮的提取。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

厚朴，产自四川；芦丁，阿拉丁（上海） 有限公司提供；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等，均为分析纯，西陇化工股份有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 厚朴总黄酮的提取

将厚朴置于60 ℃恒温烘干至质量不变，粉碎过筛（40 目），得到厚朴粉末，避光冷藏（8 ℃）备用。准确称取定量厚朴粉末，加入一定体积分数的乙醇，200 W 超声条件下，恒温加热一定时间后，以转速3 000 r/min 离心15 min，取上清液作为提取液。

1.2.2 厚朴总黄酮的测定

测定总黄酮含量的方法采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[11]。根据标准曲线（芦丁） 计算厚朴黄酮类物质含量。其中拟合的回归方程为：Y=0.012 7X-0.000 9，R2=0.999 5。

其公式为：

式中：W——总黄酮提取量，mg/g；

V——提取液体积，mL；

C——溶液质量浓度，mg/mL；

n——稀释倍数；

m——粉末质量，g。

1.2.3 单因素试验

以总黄酮提取量为评价指标，依次考查乙醇体积分数55%～95%，料液比1∶5～1∶45（g∶mL），超声温度30～70 ℃，超声时间20～60 min 四因素，分析各个因素对目标成分提取量的影响。

1.2.4 响应面设计

根据1.2.3 结果，设计响应面优化水平[12]。选取4 个自变量分别是乙醇体积分数（A）、料液比（B）、超声温度（C）、超声时间（D），选取响应值是厚朴总黄酮提取量。

Box-behnken 因素与水平设计见表1。

表1 Box-behnken 因素与水平设计

1.2.5 数据处理

所有试验均采取平行重复3 次，响应面采用Design Expert 11 设计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对目标成分提取量的影响

在料液比1∶25（g∶mL），超声功率200 W，超声温度60 ℃，超声时间40 min 超声条件下，考查乙醇体积分数55%～95%对目标成分提取量的影响。

乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响见图1。

图1 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响

当乙醇体积分数为75%时，厚朴总黄酮提取量达到最大值为30.20 mg/g。可能是因为黄酮化合物种类较多，极性范围也比较广，且乙醇在不同体积分数下的极性也不同，75%乙醇溶液的极性与厚朴中总黄酮的极性比较相似，使得目标产物比较容易溶入到溶剂中[13]。因此确定乙醇的体积分数为75%。

2.1.2 料液比对目标成分提取量的影响

在75%乙醇的体积分数，超声功率200 W，超声温度60 ℃，超声时间40 min 条件下，考查料液比1∶5～1∶45（g∶mL） 对目标成分提取量的影响。

料液比对总黄酮提取量的影响见图2。

图2 料液比对总黄酮提取量的影响

当料液比在1∶25（g∶mL） 时总黄酮提取量达到最大值为30.60 mg/g。这可能是由于料液比处于在1∶5～1∶25（g∶mL） 时，随着溶剂的量的增大而升高；当溶剂的量超过1∶25（g∶mL） 后，溶出的杂质增多，会与样品中溶出的黄酮产生竞争性，致使总黄酮提取量下降[14]，故确定料液比为1∶25（g∶mL）。

2.1.3 超声温度对目标成分提取量的影响

在料液比1∶25（g∶mL），乙醇体积分数75%，超声功率200 W，超声时间40 min 的条件下，考查温度30～70 ℃对目标成分提取量的影响。

超声温度对总黄酮提取量的影响见图3。

图3 超声温度对总黄酮提取量的影响

当超声温度为50 ℃时获得最高提取量，但当温度不断的升高，提取量却逐渐下降。这可能是当温度增加时，分子的运动也会加快，有利于总黄酮的溶出和扩散，使得提取液中有更多的目标产物；但随着温度的增加，也能使乙醇挥发速度加快，造成溶剂减少，影响总黄酮的溶出，也有可能是黄酮类成分被氧化毁坏，还可能致使其他可溶性物质的溶出[15]，从而导致了提取量的变化。故确定超声温度为50 ℃。

2.1.4 超声时间对目标成分提取量的影响

在料液比为1∶25（g∶mL），乙醇体积分数75%，超声功率200 W，超声温度60 ℃超声条件下，考查时间20～60 min 对目标成分提取量的影响。

超声时间对总黄酮提取量的影响见图4。

图4 超声时间对总黄酮提取量的影响

在超声时间为40 min 时获得最高提取量，但超过40 min 以后，提取量呈现下降的趋势。这可能是因为当超声时间过短时，其黄酮类物质还没有被完全溶出，造成提取量比较低；当超声时间过长时，样品中的黄酮类物质也有可能被部分氧化分解，从而使提取的目标产物提取量降低[16]。故确定超声时间为40 min。

2.2 响应面法优化

2.2.1 响应面分析及结果

根据单因素试验结果，对乙醇体积分数、料液比、超声温度、超声时间进行响应面优化试验，筛选出最优提取方案。

响应面试验设计及结果见表2。

2.2.2 总黄酮提取量回归模型方差分析

对表2 的数据进行二次回归拟合，得到总黄酮的二次回归拟合方程为：

表2 响应面试验设计及结果

提取量回归模型方差分析见表3。

由表3 可知，由模型p＜0.000 1 得知此模型具有极好的显著性；模型决定系数R2=0.934 5，说明有93.45%的响应值的自变量能被该模型解释。失拟项p=0.396 8＞0.05，失拟项不显著，说明此模型的拟合效果好，可对此回归模型方程进行检验。根据F值可知，各因素对总黄酮提取量的影响程度从大到小依次为超声温度＞乙醇体积分数＞料液比＞超声时间。

表3 提取量回归模型方差分析

2.2.3 响应面分析

3D 响应曲面图和等高线图可以解释自变量之间的相互作用和反映变量间相互作用。通过观察曲面的倾斜度，确定两者对响应值的影响程度。

不同因素交互作用对总黄酮含量影响的响应面图（a） 及等高线图（b） 见图5。

图5 不同因素交互作用对总黄酮含量影响的响应面图（a） 及等高线图（b）

最高的响应曲面倾斜度为温度，说明最影响目标成分含量为温度。结果与方差分析结果符合（见表3）。AC等高线接近于圆形，说明乙醇体积分数和温度的交互作用对响应值的影响不显著。AC、BC响应曲面较陡峭，等高线接近于椭圆，说明超声温度和料液比（AC）、超声时间和料液比（BC） 的交互作用对响应值的影响显著。

2.3 工艺条件优化及验证试验

通过响应面优化获得乙醇体积分数为76.78%，料液比为1∶28.2（g∶mL），超声时间为41 min，超声温度为53.63 ℃，目标成分含量预测值为31.946 mg/g。为了方便验证模型的有效性，取乙醇体积分数为77%，料液比为1∶28.2（g∶mL），超声时间为41 min，超声温度为54 ℃，在此工艺条件下得到目标成分含量为32.30±0.65 mg/g，与预测值接近，说明该试验切实可行。

3 结论

乙醇体积分数77%，料液比1∶28，超声温度54 ℃，超声时间41 min，此条件下得到目标成分含量为32.30±0.65 mg/g。通过响应面试验分析，确定了超声波辅助乙醇提取厚朴总黄酮的最佳控制点，证明经RSM法优化得到的提取工艺参数较为实用可靠，为厚朴天然成分的有效提取利用提供参考价值。