卢奎 李福伟 朱丽慧 和笑笑 卫利春 朱永豪 严华祥

摘要：为研究饲粮中镁对新杨黑羽蛋鸡鸡蛋暗斑形成和蛋壳微生物组成的影响，选取35周龄、所产鸡蛋易发暗斑的新杨黑羽蛋鸡48只，随机分成3组，每组16只（单笼饲养），分别饲喂镁浓度为843.55（A）、2 009.80（B）和3 206.05（ C） mg·kg-1的试验饲粮，为期5周，检测鸡蛋暗斑、鸡蛋品质、蛋壳微生物的差异。结果表明，与B和C处理相比， A处理鸡蛋的暗斑等级极显著降低（P<0.01），蛋白高度和哈氏单位均显著提高（P<0.05）。通过16S rDNA测序，在蛋壳表面共检测到969个OTUs，其中，A、B、C处理分别检测到670、787、848个OTUs；随着储存时间的延长，微生物OTU类别数增加；1级暗斑等级的OTU类别数极显著低于暗斑等级较高的鸡蛋（P<0.01）。综上述所，饲粮中较低的镁浓度会减少鸡蛋暗斑，提高蛋白高度和哈氏单位。

关键词：新杨黑羽蛋鸡；镁；鸡蛋暗斑；微生物；蛋壳doi：10.13304/j.nykjdb.2021.0546

中图分类号：S831.5 文献标志码：A 文章编号：10080864（2023）01019709

鸡蛋暗斑是近年来倍受关注的质量问题，改善鸡蛋暗斑可以提高经济效益。研究显示，暗斑蛋与无暗斑蛋的蛋壳存在较大差异[1-4]；鸡蛋暗斑的存在使蛋壳表面微生物更易于进入蛋壳内[1-3]；暗斑的严重程度与沙门氏菌和大肠杆菌对蛋壳的渗透作用显著相关[5]；暗斑不仅受环境温度、湿度、饲粮组成、蛋鸡品种等因素影响，同时还有个体差异[6-10]；且暗斑率随鸡蛋储存时间的延长而增加[12]。

镁是生物体必需的常量元素之一，在生物体生长、发育、繁殖方面具有重要调节作用。蛋壳中镁含量丰富[11]，镁在蛋壳形成过程中具有重要协同作用[1213]。研究表明，蛋壳形成过程中ATP酶转运系统依赖于镁离子的参与[14]；镁含量在成壳过程中先升高后维持稳定至蛋壳完全形成[15]；且饲粮中镁含量会影响鸡蛋的重量、产量以及蛋壳厚度[16]；饲粮中过量镁会导致软破蛋率上升，蛋壳乳头间空隙增大[17]；还会导致蛋雏鸡骨质疏松，胫骨抗压能力降低[18]。体外研究发现，pH 10.5的碱性溶液中镁离子可促进微生物生长[19]；镁还可以治疗破骨细胞形成和功能障碍引起的骨溶解相关疾病[20]。蛋鸡饲料原料豆粕（806.05 mg·kg-1）和石粉（0.5%～3%）中镁含量较高，因此，在配制成蛋鸡配合饲料后饲粮中的镁含量可达1 000～3 000 mg·kg-1[2122]。但是，高镁饲粮对鸡蛋暗斑和蛋壳微生物的影响尚不明确。本研究拟通过饲喂不同镁含量的饲粮，观察鸡蛋暗斑率的变化趋势，研究饲粮中镁含量对蛋壳中微生物组成的影响，探讨饲粮中镁含量对鸡蛋暗斑的影响及其作用机制，以达到降低鸡蛋暗斑、提高经济效益的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从上海市营房蛋鸡场选择35周龄、体重接近、连续３天产蛋且蛋壳表面有暗斑的新杨黑羽蛋鸡48只，随机分为3组，每组16只，单鸡单笼饲养于上海市农业科学院动物房，每日饲喂量为95 g·只-1。

1.2 试验设计

试验蛋鸡分别饲喂镁含量为843.55（A）、2 009.80（B）和3 206.05 mg·kg-1（C）3种试验饲粮。各处理饲粮组成及营养水平详见表1。其中，贝壳粉来源于江苏省连云港兴旺贝壳有限公司（镁0.05%，钙38.13%）；石粉来源于广西贺州智鑫工贸有限公司（镁3.05%，钙38.1%）。试验为期5周，试验期间蛋鸡自由采食、饮水。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 鸡蛋暗斑检测 收集试验蛋鸡当天鸡蛋，统计蛋数并舍弃脏蛋，记录日期、笼号，鸡蛋集中室温储存，2 d后检测暗斑等级。暗斑等级根据以下标准进行分级。

0级：初产1 h内没有任何暗斑的鸡蛋，光源照射时鸡蛋透光均匀、无透光点；室温放置2 d后，外观未有变化，标记为0级。

1级：不通过光源照射较难观察到鸡蛋有暗斑点，在光源下可见零星透光点，1级暗斑鸡蛋定义为非暗斑鸡蛋。

2级：鸡蛋表面有较多直径1 mm左右的暗斑点，不通过光源照射仔细观察能够看到暗斑点，光源照射下透光小点遍布鸡蛋表面，但是没有直径3 mm以上的透光点。

3级：鸡蛋表面有直径3 mm以上的暗斑点，在没有光源照射时就能够直接观察到暗斑，光源照射下能够看到1 mm左右的透光小点和3 mm左右光圈的零星斑点。

4 级：鸡蛋表面有较多直径3 mm 左右的斑点，没有光源照射就能明显观察到密布的暗斑点，在光源照射时能够清晰地观察到较多的光斑分布在鸡蛋表面，但在鸡蛋的锐端没有或有极少的斑点。

5级：鸡蛋表面暗斑点明显且密集，光源照射下斑点连缀成片状，在鸡蛋锐端有较多暗斑点。

1.3.2 产蛋率和鸡蛋品质检测 每天记录产蛋数，计算产蛋率。产蛋率计算公式如下。

产蛋率=Σ（当天产蛋枚数/存栏蛋鸡数）/统计天数（1）

在试验第1、第3 和第5 周，连续3 d 采集鸡蛋，统计蛋数并舍弃脏蛋，每组取12枚蛋，集中室温放置2 d后检测鸡蛋品质。采用全自动蛋品质测定仪DET-6000（日本Nabel 公司）测定鸡蛋重量、蛋壳强度、蛋黄颜色、蛋白高度和哈氏单位，利用蛋壳厚度测定仪测定蛋壳厚度。

1.3.3 蛋壳微生物分类测序 对产蛋当天未检测到暗斑的鸡蛋在当天（0.5 d）以及集中室温储存2、7、14 d后的蛋壳表面微生物进行测序和分析。

取4个储存时间下3种镁含量饲粮处理的鸡蛋各8枚（共96枚），将蛋壳研碎后，加入50 mL 0.9%氯化钠溶液于250 mL盐水瓶，在摇床摇30 min后取出，超净工作台静置20 min，静置后抽取上清液1 mL，使用Hipure Bacterial DNA Kit试剂盒（上海迈跟生物科技有限公司）抽提DNA；采用QuawellQ3000超微量分光光度計测定DNA纯度和浓度；然后采用16s rDNA引物对DNA进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的长度和完整性；检测合格的产物送生工生物工程股份有限公司进行微生物分类测序。

1.4 数据分析

1.4.1 鸡蛋品质数据统计分析 用Excel 2010和SPSS 21.0统计软件进行数据整理和分析。

1.4.2 蛋壳微生物数据分析 二代测序得到的初始 reads首先根据overlap 关系进行拼接，区分样本后对序列质量进行质控和过滤；然后进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）聚类分析和物种分类学分析。基于OTUs聚类分析结果，对OTUs进行多样性分析，并检测测序深度；基于分类学信息，在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。在上述分析的基础上，对多样本的群落组成和系统发育信息进行Beta多样性分析、分组检验分析、差异显著性分析、环境因子關联分析、关联与模型预测分析和功能预测等一系列深入的统计学和可视化分析。

2 结果与分析

2.1 饲粮镁水平对鸡蛋暗斑的影响由图1可知，在预试验期间各处理鸡蛋的暗斑等级均集中于2和3级，处理间无显著差异。在试验第2～5周，与B、C处理相比，A处理鸡蛋的暗斑等级明显降低，暗斑等级为1级的鸡蛋占比较高；随着饲喂时间的延长，不同处理对鸡蛋暗斑的影响趋于稳定。

2.2 饲粮中镁水平对常规鸡蛋品质的影响由表3可知，饲粮中镁含量显著影响鸡蛋的蛋白高度和哈氏单位（P<0.05），对产蛋率、蛋黄颜色、蛋重、蛋壳强度和蛋壳厚度无显著影响（P > 0.05）。A处理鸡蛋的蛋白高度和哈氏单位显著高于B和C处理（ P <0.05）；而B、C处理间鸡蛋的蛋白高度和哈氏单位无显著差异（P > 0.05）。

2.3 饲粮镁水平对蛋壳微生物的影响

2.3.1 饲粮镁水平对蛋壳微生物物种数量的影响 比较A、B和C处理鸡蛋蛋壳微生物菌群的差异，结果（图2）表明，A、B和C处理的蛋壳微生物中分别检测到670、787和848个OTUs；其中，共有的OUT数量为 567。C处理特有的OUT数量分别是A和B处理的6.1和2.1倍。在属水平上，共有334个属，其中，A处理有5.28%与其他2组水平不同，B处理有10.96%与其他2组不同，C处理有14.85%与其他2组不同。

2.3.2 饲粮镁水平对蛋壳微生物分布的影响 由图3 可知，各处理的OTUs 指数差异显著（P=0.017）； Shannon 指数差异不显著。对于OTUs指数，A、B处理间差异极显著（P<0.01）；A、C处理间差异显著（P<0.05）；B、C处理间差异不显著。不同处理的Shannon指数表现为C>B>A。

由图4可知，蛋壳微生物主要包括厚壁菌门、变形菌门和蓝藻细菌。厚壁菌门在A和B处理中的占比相近；在C 处理中的占比较A 处理提高17.88%。变形菌门在A和B处理中的占比相近；在C处理中的占比较B处理降低19.54%。蓝藻细菌在A 处理中的占比最高，分别是B、C 处理的7.75和2.48倍。

2.4 不同储存时间对蛋壳微生物的影响

如图5所示，随着鸡蛋储存时间的延长，检测到的OUTs数量越多；且随着饲粮中镁含量的增加，检测到的OUTs数量越高。在鸡蛋储存2 d以内，A处理的蛋壳微生物OUTs数量最少，B处理次之，C处理最多。在鸡蛋储存2 d以后，C处理蛋壳微生物的OUT数量降低。鸡蛋储存7 d后，B和C处理蛋壳微生物的OUT数量均有所降低。

如图6所示，A处理3个不同储存时间的蛋壳微生物中存在显著差异的物种共有15种，其中，储存时间为0.5 d的显著差异物种为1种，2 d的为6种，14 d的为8种。

2.5 不同暗斑等级蛋壳微生物的比较

暗斑等级为1级的蛋壳微生物OTU数量极显著低于其他等级；与2～5级相比，1级的OUT数量和特有的OUT均最少， 2～5级间差异较小（图7）。储存2 d 时， 1～5 级暗斑等级的蛋壳微生物OUT数量分别为327、477、542、475和428；储存7 d时，1～4 级的蛋壳微生物OUT 数量分别为198、496、470 和408；储存14 d 时， 1～4 级的蛋壳微生物OUT数量分别为220、389、557和402。

如图8所示， 1、2、3、4和5级暗斑等级的蛋壳微生物中显著差异物种的数量分别为3、5、12、2和12 种。其中，1 级暗斑等级的蛋壳微生物中OTU95（布劳特氏菌属）和OTU25（乳杆菌属Lactobacillus）的影响作用较强；2级暗斑等级的蛋壳微生物中消化链球菌科和OTU566（毛螺菌科）的影响作用较强； 3级暗斑等级的蛋壳微生物中毛螺菌科和疣微菌科的影响作用较强；4级暗斑等级的蛋壳微生物中OTU57、OTU568（乳杆菌属）的影响作用较强；5级暗斑等级的蛋壳微生物中气球菌科和葡萄球菌科的影响作用较强。

3 讨论

3.1 饲粮中镁浓度对鸡蛋品质的影响

镁元素在蛋鸡体内的吸收与利用是个复杂且严密的过程，受采食量以及蛋鸡体内多种激素调节等各种因素的影响；饲粮中的镁含量（207 mg·kg-1）会影响鸡蛋的重量、产量以及蛋壳厚度[16]；饲粮中过量镁（6 000 mg·kg-1）会导致软破蛋率上升，蛋壳乳头间空隙增大[17]。本研究结果表明，饲粮中镁含量对产蛋率、蛋重、蛋黄颜色、蛋壳强度和蛋壳厚度无显著影响，对蛋白高度、哈氏单位有显著影响；与饲喂镁含量2 009.80和3 206.05 mg·kg-1的饲粮相比，饲喂843.55 mg·kg-1镁含量饲粮蛋鸡所产鸡蛋的蛋白高度显著增加，哈氏单位显著提高，与王安等[17]的研究结果一致。这可能与蛋壳微生物的种类及数量有关，微生物在蛋壳生长可能会破坏蛋壳有机质等。饲喂高镁含量的饲粮增加了微生物进入鸡蛋的风险，因此，应尽量使用低镁含量的饲粮饲喂蛋鸡。

3.2 饲粮镁含量、鸡蛋暗斑和鸡蛋微生物的关系

本研究显示，与饲喂镁含量2 009.80 和3 206.05 mg·kg-1的饲粮相比，饲喂镁含量843.55mg·kg-1饲粮可明显降低鸡蛋的暗斑程度，减少蛋壳微生物OTUs数量；随着饲料中镁含量的增加，鸡蛋暗斑程度增加，蛋壳微生物数量增多，表明鸡蛋暗斑与蛋壳微生物数量存在一定的关系，推测暗斑鸡蛋促进了微生物的生长[12，5]。暗斑鸡蛋的蛋壳栅栏层致密性较差[1，4]，可能这些位置的一些物质含量或分布发生了变化。本研究显示，饲喂过量镁可导致蛋壳中微生物数量增加，暗斑蛋的发生率提高，可能是蛋壳微生物生长吸收了一部分蛋壳成分，使得蛋壳致密性降低，从而形成暗斑。刚产出的鸡蛋表面携带粪便微生物，当粪便微生物进入蛋壳生成菌斑后便形成了蛋壳暗斑，且微生物菌斑的数量和直径与暗斑等级相关；当粪便微生物无法进入蛋壳或进入后不能生长时，便无法形成暗斑或暗斑等级较低[2223]。唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）SNK-6 能降低鸡蛋暗斑，蛋鸡采食乳酸杆菌可改变肠道微生物种类和分布，提高粪便中唾液乳杆菌数量[21]。本研究表明1级暗斑等级的蛋壳微生物的优势菌之一OTU25为乳杆菌属，推测蛋壳表面的优势菌群未能在蛋壳内形成菌斑是鸡蛋暗斑等级较低的原因。

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（责任编辑：张冬玲）