张玮杰

郑州大学第五附属医院药学部，河南郑州 450052

关节炎是多因素共同作用后引起的炎性疾病，其临床表现及诊治时长都给患者的日常生活带来诸多不便。菊科植物红花具有止痛散肿，活血润燥的功效。临床上多用于跌扑损伤、疮疡肿痛等。诸多含红花成分的中成药在老年人风湿骨痛治疗方面发挥重要作用，如红花油、红花如意丸等。因此，红花在治疗关节炎方面具有较高的应用前景。网络药理学作为一门新兴学科，可以从生物网络平衡角度，解释疾病的发生发展，为指导新药的研发提供诸多便利[1]。另外，网络药理学整体性、系统性的特点与中医整体观、辨证论治原则十分契合[2]，这为探究中药的作用机制提供更好的思路和方法。基于此，本研究运用网络药理学技术，对红花治疗关节炎的机制进行探究。

1 材料与方法

1.1 红花活性成分及靶标蛋白的筛选

在中药系统药理学分析平台TCMSP（http://tcmspw.com）检索红花的活性成分及对应靶点。活性成分的筛选标准是口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30% 和 类 药 性（drug like，DL）≥0.18。靶标蛋白和基因信息通过Uniprot（https: //www.uniprot.org/）数据库作标准化校正。

1.2 关节炎相关靶点的筛选

通过 GeneCards（https: //www.genecards.org/）数据库获取疾病的相关基因，并以“arthritis”为检索词语，进行检索和筛选。

1.3 靶点网络构建

运用Cytoscape 3.7.2进行“药物-成分-疾病-靶点”的网络构建，进行中心性分析。

1.4 蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction networks，PPI）的构建和核心靶点的筛选

将交集靶点传输到STRING（https: //string-db.org/）数据库，选取分值＞0.9的高置信度区间，获取蛋白相互作用网络。并通过Cytoscape 3.7.2进行可视化处理。

1.5 红花治疗关节炎的通路筛选

将潜在作用靶点通过R 4.0.1软件，进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析和京都基因百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，筛选条件限定为P＜ 0.05。

2 结果

2.1 红花主要活性成分筛选结果

TCMSP数据库获得红花成分共189个，根据OB≥30%和DL≥0.18获取目标活性化合物22个。检索这189个红花成分对应的药物靶点，共得到1466个，筛选出主要活性成分对应的靶点并去重，得到对应的靶点蛋白共186个。

2.2 红花治疗关节炎潜在靶点的筛选结果

以“arthritis”为关键词，运用GeneCards数据库进行检索，将物种选择为人类，获得关节炎相关的靶点6532个。将红花和关节炎相关靶点导入在线韦恩图得到交集靶点（图1）。可以看出红花和关节炎的共同靶点有156个。

图1 红花潜在靶点和关节炎疾病靶点的韦恩图

2.3 药物-成分-疾病-靶点网络构建

利用Cytoscape 3.7.2软件将红花及其活性化合物、靶点之间的关系可视化（图2）。利用Network Analyzer插件分析各节点的网络参数，通过综合考虑节点关系，筛选出排名前十的主要活性成分，分别是槲皮素、木犀草素、山奈酚、黄芩素、β-胡萝卜素、豆甾醇、β-谷固醇、6-羟基山奈酚、六羟黄酮和植物固醇。

图2 “药物-成分-疾病-靶点”相互作用网络图

2.4 PPI的构建和潜在关键靶点的筛选

将药物与疾病交集靶点上传到STRING数据库得到PPI网络图（图3A）。该网络共有156个节点蛋白，以连接节点数为筛选标准，筛选出30个基因，将其进行可视化（图3B）。筛选出排名前十的靶点基因，其分别是 JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL6、APP、MAPK8、CXCL8、FOS和 EGFR。

图3 PPI图

2.5 潜在靶点的GO富集分析和KEGG通路分析

通过 R 4.0.1，以P＜ 0.05，q＜ 0.05 为筛选条件，进行GO功能富集分析。将富集程度最高的前20条通路制作成条形图（图4A）。GO富集分析结果表明红花与关节炎交集基因的功能主要是影响某些生物因子的活性，以及部分受体的结合。根据基因比（富集基因占所有靶基因的比例）筛选出排名前10的富集分析结果，它们是DNA结合转录因子结合核受体活性（DNA-binding transcription factor binding nuclear receptor activity）、核 受 体 活 性（nuclear receptor activity）、配体激活的转录因子活性（ligandactivated transcription factor activity）、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA结合（RNA polymeraseⅡ-specific DNA-binding）、转 录 因 子 结 合（transcription factor binding）、细 胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、转录辅激 活 子 结 合（transcription coactivator binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、转录辅助因子结 合（transcription cofactor binding）、药 物 结 合（drug binding）、抑制转录因子结合（repressing transcription factor binding）。

通过R 4.0.1，将交集基因进行KEGG通路富集分析，选取前20条通路制成条形图（图4B）。KEGG通路分析结果显示红花和关节炎交集的基因主要涉及一些炎症及癌症相关的代谢通路。根据基因比筛选出排名前10的富集分析结果，它们是糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（hepatitis B）、流体剪切应力和动脉粥样硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、前列腺癌（prostate cancer）、卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、人巨细胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、IL-17 信 号 通 路（IL-17 signaling pathway）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）、膀胱癌（bladder cancer）、胰腺癌（pancreatic cancer）。

图4 红花治疗关节炎潜在基因通路分析结果

3 讨论

红花作为一味常用的活血调经类中药，无论是单一使用还是复方配伍，均发挥重要作用。本研究基于网络药理学技术，探究红花治疗关节炎的潜在机制。通过药物-成分-疾病-靶点网络的构建，筛选出红花治疗关节炎的主要活性成分。根据化合物分子结构可以将这些活性成分分为黄酮、黄酮醇和甾醇等。黄酮类化合物是最丰富的酚类化合物，具有抗氧化、抗炎和免疫调节的特性[3-5]。饮食中的类黄酮可减轻关节炎相关症状[6]。槲皮素作为具有较强抗炎和免疫抑制的生物活性类黄酮，是治疗类风湿性关节炎的潜在药物[7]。有研究发现木犀草素可通过抑制Raf1活性来减轻关节炎中性粒细胞的氧化应激[8]。有证据表明山奈酚可减轻关节炎模型小鼠的关节炎严重程度[9]。黄芩素可以通过减弱核因子（nuclear factor，NF）-κB的活性并抑制炎症细胞因子和趋化因子的表达来发挥抗氧化和抗炎活性[10]。有研究报道合适地摄取β-胡萝卜素可以预防NLRP3炎性体质相关疾病，如关节炎、痛风等[11]。β-谷固醇和欧前胡素可以协同作用缓解胶原蛋白诱发的关节炎[12]。综上，通过网络药理学筛选出的槲皮素、木犀草素等红花中的活性成分，在关节炎治疗过程中发挥重要作用，且大部分化合物的作用效果也已得到实验证实。

关节炎是人体自身免疫性疾病，其炎症细胞因子的合成失衡会导致人体的软骨和骨遭到破坏[13]。长期关节炎的折磨，显著增加中老年人患抑郁症的概率[14]。通过PPI网络分析，发现JUN、AKT1、MAPK1、RELA和IL-6等是红花治疗关节炎的关键靶点。MAPK是传递细胞信号的重要一步，它可以参与调节细胞的炎症反应等多种细胞生理及病理过程。RELA作为NF-κB的亚单位，可以参与许多细胞的生物学进程，其中就包括炎症和免疫等。通过靶向NF-κB可用于关节炎的治疗[15-16]。研究发现槲皮素可以通过MAPK和NF-κB信号通路达到抑制ARPE-19细胞中由IL-1β诱导的炎性细胞因子和趋化因子的产生[17]。且槲皮素能降低稳定型冠状动脉疾病中NF-κB的转录活性[18]。以上研究都为探究槲皮素通过靶向NF-κB治疗关节炎提供依据。

GO富集分析结果表明红花与关节炎交集基因的功能主要影响某些生物因子的活性以及部分受体的结合，这与前面筛选出的核心靶标基因一致，表明红花中的活性成分很可能通过靶向MAPK1、RELA等关键靶点干扰细胞因子等大分子的结合功能。KEGG信号通路分析结果显示关键靶标基因主要参与的信号通路为糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等。许多研究表明，炎症细胞因子是关节炎的诱因，MAPK、NF-κB等信号通路是与关节炎相关的信号通路[13，19]。

综上所述，红花通过其主要活性成分槲皮素、木犀草素，作用于MAPK1、RELA等一系列关键靶点，促进细胞因子以及大分子间相互结合，从而使AGE-RAGE信号通路等多条通路发生变化，从而发挥治疗关节炎的作用。这也体现出了中药中的多成分、多靶点、多通路的作用特点。