陈慧莲，陈春梅，陈姝月，袁若梅，陈 思，陈 建，陈 杰，颜子乙， 苗成林，王 霞，崔亚利,△

(1.四川省眉山市妇幼保健院 a.检验科，b.医务科，c.院长办公室，四川 眉山 620000；2. 四川大学华西第二医院检验科，四川 成都 610041)

细菌性脑膜炎是一种中枢神经系统(central nervous system, CNS)炎症性疾病，通过脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中存在的细菌来明确诊断。肺炎链球菌是脑膜炎的主要原因，它介导的血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)破坏导致急性症状，其病死率高达30%，有50%的幸存者出现神经系统并发症[1, 2]。虽然目前对于肺炎链球菌如何与大脑环境相互作用的研究不断增多，但对肺炎链球菌脑膜炎(pneumococcal meningitis, PM)在BBB病理分子水平上的发病机制及神经系统后遗症的研究仍不完整，这也是本文拟探讨的问题。

1 急性肺炎链球菌脑膜炎中的BBB

1.1 BBB的结构和功能BBB是防止病原体入侵CNS 的一个重要结构，它由表达高度选择性紧密连接的专职内皮细胞，及沿基底膜的调节和支持性周细胞和星形胶质细胞组成，其他支持性细胞还包括血管周围巨噬细胞(perivascular macrophages, PVM)，是中枢神经系统和周边系统之间沟通的关键因素，在大脑中，星形胶质细胞支持BBB的功能，调解内皮细胞和神经元的相互作用，而小胶质细胞可以安装到BBB上，同时小胶质细胞可以通过调节抗炎和促炎巨噬细胞之间的平衡来启动不依赖抗原的先天免疫反应[3]。作为血液循环和脑间质之间连续的非分化细胞的功能屏障，BBB 不仅可以调节离子和分子的通过，确保CNS 平衡，保护其免受毒素和病原体的入侵，还能调节宿主免疫细胞外渗到脑实质中，从而影响局部炎症反应[4]。

通过保护CNS 不受外周免疫细胞和抗体的影响，BBB 促进了典型的CNS 免疫特权，并且新发现的硬脑膜中的淋巴管，即脑膜淋巴系统，可将液体和免疫细胞从蛛网膜下腔排入颈部深层淋巴结[5]。CNS淋巴管的存在使白细胞(如记忆性T淋巴细胞)能以非病理性的方式进入CNS，这被认为是正常神经功能的必要条件[6]。因此，作为一个物理和免疫屏障，BBB在脑部感染期间充当了保护性静态监测的关键决定因素。

1.2 肺炎链球菌跨越BBB迁移到中枢神经系统肺炎链球菌在鼻腔内的定植是PM致病的第一步，几乎30%的人都有无症状的肺炎链球菌鼻腔带菌现象，儿童和新生儿感染率更高[2]。肺炎链球菌可以从鼻咽部发展到内耳腔、肺部或侵入组织内的血管内空间从而进入血液，分别引起中耳炎、肺炎或败血症[7]。一旦肺炎链球菌成为血源性，继而可以通过BBB侵入CNS，在此过程中，其关键毒力因素便可发挥重要作用[8]。

1.2.1肺炎链球菌荚膜肺炎 链球菌荚膜是一个200～400 nm厚的多糖壁，是细菌入侵能力的重要毒力因子，荚膜的高度表达增强了细菌的免疫逃避，有研究证实，有荚膜的肺炎链球菌显示出对噬菌体和吞噬作用的抵抗力更强，能够减少补体在其表面的沉积[9]。然而，由于荚膜抑制了肺炎链球菌表面蛋白(pneumococcal surface proteins, Psp)黏附分子的结合点而对细菌定植是不利的。肺炎链球菌变异最终能通过数量感染和周期调控来改变荚膜的表达，使荚膜从厚重过渡到透明，通过调节细胞质膜上寡糖重复的生物合成，在荚膜多糖生物合成基因座上编码。血清型相关证据表明，肺炎链球菌通过荚膜调节介导的免疫逃避机制(如抗吞噬作用)在不同血清型中有所不同。

1.2.2Psp Psp推动鼻咽/血流和血流/脑边界的成功易位，肺炎链球菌的纤毛能够使细菌附着在内皮细胞上，通过肺炎链球菌菌毛相关的黏附素(RrgA)与宿主的聚免疫球蛋白受体(poly immunoglobin receptor, plgR)和血小板内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule, PECAM-1)结合，以促进肺炎链球菌跨越BBB的转移，是细菌进入CNS的重要因素[10]。表面的神经氨酸酶A可以通过内皮层蛋白G样凝集素结构域促进内皮细胞的结合。有证据表明，肺炎链球菌在BBB的初始易位发生在蛛网膜下腔血管内皮的黏附，然后才发展到皮质和脉络丛的内皮细胞[11]。

胆碱结合蛋白(choline-binding proteins, Cbp)通过磷酰胆碱和细胞壁的茶胶成分附着在肺炎链球菌表面。Cbp包括肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)和胆碱结合蛋白A(CbpA)，它们破坏补体途径以抑制免疫细胞的吞噬作用，PspA还增加了肺炎链球菌对人类乳铁蛋白的杀伤力，与溶菌酶协同工作，诱导肺炎链球菌裂解，CbpA还与人类免疫球蛋白受体结合，包括PlgR以及内皮细胞上的血小板活化因子(platelet-activating factor, PAF)受体，因此，CbpA可以介导黏膜入侵，以及肺炎链球菌跨越BBB的运输[8, 12]。此外，肺炎链球菌磷脂酶A2(phospholipase A2, PLA2)是一种分泌型的细菌酶，调节炎症，也是PM的一个临床预测指标，PLA2的产生与宿主血管内皮细胞中黏附分子的上调有关[13]。

1.2.3溶血素肺炎链球菌溶血素(pneumolysin, Ply) Ply是由人类致病菌肺炎链球菌产生的一种成孔毒素，可在宿主细胞中形成跨膜孔，破坏质膜完整性并破坏细胞稳态,通过膜穿孔和激活炎症途径促进疾病发展，同时通过触发宿主细胞修复和启动抗炎反应。Ply的过度促炎作用会增强组织损伤并促进细菌传播。在上皮细胞中，Ply诱导促炎细胞因子和趋化因子的产生，促进中性粒细胞迁移并损害上皮屏障功能。Ply同时也会通过干扰脑外膜纤毛，对上皮细胞和内皮细胞都有直接的细胞毒性作用，并引发小胶质细胞和神经元细胞死亡，Ply诱导的成孔也影响到胶质细胞，改变星形细胞结构，增加整体BBB的渗透性。Ply可以独立激活巨噬细胞，也可以与其他共刺激剂联合激活，从而释放促炎细胞因子和趋化因子。Ply的抗炎活性下调免疫反应也可能有助于细菌逃避[14]。

1.3 宿主炎症反应在决定肺炎链球菌脑膜炎结果中的作用

1.3.1小胶质细胞 作为脑常驻巨噬细胞，小胶质细胞是早期防御免疫系统的调控者，它们会吞噬活的肺炎链球菌，并能通过模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)，如TLR和NLR感知病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)。在对细菌入侵的反应中，小胶质细胞释放细胞因子和趋化因子，煽动白细胞对细菌入侵的浸润反应，向T细胞提呈抗原，并可能通过抗菌肽对肺炎链球菌产生直接的细胞毒性作用[15]。

1.3.2模式识别受体 在肺炎链球菌脑膜炎期间，CNS内的一系列PRR途径被触发，后者通过宿主抗菌反应和相关CNS功能破坏影响结局。TLRs存在于神经胶质细胞中，并具有感知各种PAMPs和细菌来源的风险相关分子模式(danger-associated molecular patterns, DAMPs)的选择能力。在PM中，一些毒力因子或相关蛋白可以触发这些受体，如胶质细胞上表面结合的TLR2在识别细胞壁中的肽聚糖和脂藻酸时被激活，Ply刺激TLR4，核内体TLR9对肺炎链球菌基因组DNA中的CpG基团有反应，但需事先进行表面识别并将细菌吸收到内溶酶体或吞噬溶酶体中[16]。炎症小体由PRR、一个典型适配蛋白和caspase-1酶(CASP1)组成。炎症小体的激活最终导致CASP1将IL-1β和IL-18的前体裂解为可释放的活性形式，活性IL-1β的释放有助于炎症的增加，而IL-18的释放可以调节PM中依赖干扰素-γ(IFNγ)的发病机制[17]。

1.3.3白细胞浸润 在PRR介导的小胶质细胞激活后，胶质细胞发起的白细胞浸润驱动了与PM相关的促炎反应。在白细胞浸润发生前，内皮细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞局部产生IL-6、TNF和 IL-1β，这些细胞因子的水平升高提示了典型的PM。CNS中趋化因子上调是PM的特征，这些趋化因子参与白细胞的招募和迁移，由包括小胶质细胞在内的常驻免疫细胞产生的趋化因子配体(CCL)2、CCL3、CXCL8和CXCL1调节中性粒细胞、单核细胞和T细胞趋化，而CXCL1和CXCL3与自然杀伤细胞招募有关，在BBB，趋化因子如CXCL12、CCL11和CCL21激活整合素，诱导白细胞黏附，CXCL12被证明能诱导T细胞的停滞和缓慢，以及在体外介导单核细胞对人类血管内皮细胞的黏附[18, 19]。白细胞在CNS中形成的机制尚不明确，但白细胞的迁移是通过内皮细胞间的旁路或通过BBB细胞的跨细胞途径进行的，粒细胞的迁移显示出对经典细胞途径的偏爱，中性粒细胞可能在控制大脑中的肺炎链球菌方面具有多方面的作用。

在PM中，中性粒细胞占浸润白细胞的90%，尽管高白细胞计数与临床结果的改善有关，但实验性白细胞耗竭可减少中枢神经系统的损伤并提高生存率[20]。相反，特异性中性粒细胞耗竭导致小鼠大脑中细菌数量增加，生存率恶化，而CNS中长期存在的中性粒细胞会增加出血和水肿。阐明白细胞在CNS感染中的双重保护和有害作用，对了解发病机制和开发PM的治疗方法至关重要。

CNS中留存的白细胞进一步促进了细胞因子环境，形成“细胞因子风暴”。在临床上，CSF中炎症细胞因子TNF、IL-1β、IFNγ和IL-6水平一直是可定量的，并与脑膜炎的死亡率相关[21]。在实验性PM中，尽管TNF完全缺失会导致死亡率增加，高水平的腹腔TNF与中性粒细胞浸润增加了BBB的破坏。IL-6基因敲除的小鼠同样显示出死亡率的增加，尽管在这种情况下，BBB通透性和脑水肿被削弱了。CASP1基因敲除小鼠中IL-1β水平的降低与BBB完整性的改善有关，然而，IL-1受体敲除小鼠被发现有更大的BBB侵袭，CNS中的肺炎链球菌数量增加，表明IL-1信号的某些方面参与了PM的宿主保护[22]。尤其是IFN-γ水平与其他病原体引起的细菌性脑膜炎中的PM相关，在人类患者中都有CSF水平升高的报道和实验模型，IFN-γ能激活巨噬细胞和抗原呈递细胞，并与IL-1β一起调节其他细胞因子的产生，使其成为细胞因子风暴的一个重要调节器[23]。它由常驻的中枢神经系统细胞、浸润的自然杀伤细胞和激活的T细胞产生，在小鼠模型中，它的产生是通过一个涉及炎症小体、IL-12和IL-18途径诱导的。IFN-γ基因敲除的小鼠在实验性PM中免于死亡，并显示CSF中细菌清除率的提高和BBB通透性的降低，这些研究共同强调了细胞因子环境在调控BBB完整性和PM发病机制方面的看似不一致和复杂性。

1.3.4反应性氧和氮物质 小胶质细胞和内皮细胞等常驻中枢神经系统的细胞以及渗入的白细胞在吞噬过程中会释放活性氧和氮化物(reactive oxygen and nitrogen species, RONS)，其水平在患者CSF和患有PM的实验动物的CSF和大脑中均有升高[24]。肺炎链球菌进入CNS后继续繁殖或进行自溶，其中任何一个过程都能诱发过氧化氢产生，对附近的宿主细胞造成细胞毒性，过氧化氢还与宿主产生的一氧化氮反应，形成过氧化氢，而过氧化氢又能通过脂质过氧化作用破坏宿主细胞膜、蛋白质羰基的形成和基质金属蛋白酶的激活，此外，中性粒细胞衍生的髓过氧化物酶将过氧化氢转化为次氯酸，激活基质金属蛋白酶(MMP)-9，推动BBB破裂[25]。在PM中，用过氧化氢清除剂与抗生素治疗同时进行，可降低局部IL-1β水平，减少白细胞对CSF的浸润。同样，用过氧化氢清除剂过氧化氢酶和超氧化物歧化酶治疗，可减少PM的脑水肿。

在脑膜炎患者和实验动物大脑中可以观察到亚硝酸盐/硝酸盐和一氧化氮的代谢产物，一氧化氮合成酶(nitric oxide synthases, NOS)，如NOS2与BBB的破坏和实验性PM中促炎因子的增加有特殊关系，参与调节海马中caspase-3驱动的神经元凋亡[26]。有趣的是，内皮细胞NOS1似乎有保护作用，NOS1的缺乏与BBB破裂、白细胞浸润的增加有关，诱导性NOS2由浸润的单核细胞产生，在实验性PM中部分由IFN-γ调节，NOS2表达的增加与血清亚硝酸盐水平、BBB通透性和蛋白质涌入大脑有关，NOS2的缺乏与完全的BBB保护有关，同时水肿减少，大脑中促炎症细胞因子的浓度降低，以及死亡率降低，相应地，自由基清除剂治疗减少了PM大脑中的NOS2水平，也与白细胞浸润的减少和死亡率的提高有关[27]。总的来说，RONS既起保护作用，也起有害作用，这些分子的产生和作用部位可能决定了它们在PM中的影响。

1.3.5基质金属蛋白酶(MMP) MMP是依赖锌的内肽酶，由活化的白细胞分泌，并与PM中的BBB损伤有特殊关系，MMPs可降解细胞外基质，MMP8和MMP9在细菌性脑膜炎患者的CSF中明显增加，其中MMP9与BBB功能障碍和神经元凋亡有关[28]。抑制MMP与抗生素治疗相结合，可以保护PM的实验性海马损伤，并提高存活率，MMP2和MMP9的单一和双重抑制可减少海马和/或大脑皮层的BBB破坏，相应地，金属蛋白酶肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)也被认为能促进MMP的释放，抑制TACE对实验性PM的中枢神经系统损伤、神经系统症状和死亡率有保护作用[29]。

2 肺炎链球菌脑膜炎的血脑屏障破坏和长期神经系统后遗症

逃避宿主的物理和免疫屏障使肺炎链球菌进入CNS，从而引发一连串的炎症反应并招募免疫细胞到该部位，这个过程导致了一个可渗透的BBB，使肺炎链球菌和浸润的白细胞通过多个正反馈回路进一步增强宿主的免疫反应，一个平衡的宿主免疫反应有助于PM的完全康复。然而，许多PM病例可能会出现免疫反应失调，导致广泛的神经系统并发症，造成终身残疾，包括行为障碍、认知障碍和听力障碍[30]。

一般来说，失调的宿主炎症反应会导致两个主要的灾难性事件：氧化应激和细胞因子风暴。这两个事件与细胞损伤和损害有关，包括破坏BBB以进一步引发持久的脑损伤。用抗氧化剂治疗对实验性PM的长期神经系统缺陷有好处，过氧亚硝酸盐清除剂可以减少听力损失，而用N-乙酰半胱氨酸辅助治疗可以减少记忆力下降和听力损失，与此类似，在实验性PM中辅助使用基质金属蛋白酶抑制剂可以减少对BBB和大脑皮层的损害，并恢复认知障碍，而海马体的神经元损伤已被发现与人类和动物脑膜炎幸存者的学习障碍和认知缺陷呈正相关[31]。

近期有研究对细胞因子风暴及其对CNS的临床影响进行了回顾，参与驱动PM发病机制的显著促炎和抗炎介质，如IL-6、IL-1β、IFN-γ、IL-10和转化生长因子-β，已被证明可调节神经祖细胞的生存、增殖和分化，IL-6、TNF和IL-1β在急性PM期间导致疾病行为的主要细胞因子的过度表达，可能导致神经或内分泌回路的长期敏感化，如下丘脑-垂体-肾上腺轴，这些通路调节情绪、行为和认知，在实验性PM中，急性IL-1β水平与神经系统后遗症的发生率相关，并与BBB的完整性成反比[32]。

暴露于病理水平的炎症细胞因子也可能通过表观遗传机制导致不可逆的细胞遗传变化，从而导致神经行为功能的改变，有研究报道，与野生型小鼠相比，缺乏IFN-γ的小鼠的BBB通透性和细胞因子产生减少[33]。从长期来看，IFN-γ基因敲除小鼠的免疫反应受到抑制，被证明可以在PM中存活，海马和皮质的脑损伤减少，这与行为障碍和认知灵活性的改善有关。总的来说，这些发现表明氧化因素和一些细胞因子导致急性疾病幸存者PM对神经系统的长期影响。

3 结论及展望

作为治疗手段的BBB修复目前还没有得到充分利用。多发性硬化症中的糖皮质激素治疗已被证明可改善BBB的完整性，并下调破坏BBB的效应物，如血管内皮生长因子。在临床患者中，辅助性的皮质类固醇治疗减少了成年PM患者的死亡率以及听力损失和神经系统的后遗症，地塞米松作为辅助治疗与抗生素一起使用，可降低CSF中MMP9的水平及整个中枢神经系统的炎症和长期缺陷[34]。保护BBB的完整性是感染性脑部疾病(如细菌性脑膜炎)以及非感染性神经系统疾病(包括阿尔茨海默病、癫痫、缺血性中风和多发性硬化症)中神经系统保护的关键。众所周知，细胞因子的诱导、氧化应激以及细菌毒素的产生会损害PM患者中BBB的完整性，随后与引起急性颅内并发症和持久的神经功能紊乱有关。测量BBB破坏在脑膜炎研究中并不常见，而CNS白细胞增多和/或促炎症细胞因子和趋化因子增高通常是BBB破坏的公认代表，因此，BBB的维持非常重要且是一个潜在的治疗目标。