王海英，王慧，屈慧，杨玉珍，马飞，卢杰，王慧青

（内蒙古河套酒业技术中心，内蒙古巴彦淖尔 015400）

生产浓香型白酒，窖泥是基础，大曲是动力，工艺是关键。做浓香型优质酒，首先要抓好窖泥质量，窖泥的好坏直接决定着酒质的优劣。窖泥是己酸菌、甲烷菌、丁酸菌等各种有益物的载体和栖息场所，也是繁衍温床，这些有益微生物的种类和数量的多少是衡量窖泥质量的标准。同时适当含量的理化指标也可保证窖池中正常的微生物代谢，也是判定窖泥质量好坏的重要标准。

本课题探究在和制窖泥时添加克氏梭菌菌液、其他菌液和不添加菌液，通过对3 种窖泥理化指标、微量成分与微生物区系的监控与分析，探究添加克氏梭菌的窖泥和其他的区别及差异性，系统掌握窖泥在发酵培养过程中营养物质、代谢成分和微生物种群的变化规律，确定和总结己酸菌对提升和改善窖泥品质的效果，从而为生产高质量的窖泥奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料及实验方案

1.1.1 菌种

厂内老窖泥中分离的产己酸的细菌，经过鉴定为一株克氏梭菌；31#复合菌种。

1.1.2 培养基

采用巴氏培养基培养，培养时间为其繁殖的对数期。

1.1.3 试验条件及方案

1.1.3.1 设备

不锈钢大盆；2000 mL 玻璃烧杯；上海博讯HPX-9272MBE 数显电热培养箱；和制铁铲、封口膜、橡胶圈等。

1.1.3.2 条件

和制场地为实验室和制，密封发酵，实验室34 ℃恒温培养。

1.1.3.3 窖泥和制方法

和制方法按照我厂QJ/NHJ G.12-2020 人工窖泥生产工艺规程和制窖泥，在润好的黏黄土中，加入大曲粉2.50%、豆饼粉1.50%、鲜糟5%、窖皮泥5 %、泥炭10 %等物料充分翻拌，保证所有物料混合均匀，再加入黄水5%，液体功能菌液15%，和制均匀，于分装容器内密封发酵，培养箱内培养。

1.1.3.4 方案

按照1.1.3.3 窖泥和制方法和制窖泥，共设计3个实验方案，除菌种外其他基础配料和比例均一样。每个方案，分装15 个平行样并且分装的每个平行样品重约1.8 kg，以备取样检测。在后续分析时F1 对照方案记为dz；F2 克氏方案记为ks；F3 复合方案记为fh。具体方案见表1。

表1 实验方案

1.1.4 取样时间

3 个方案中，在每个方案的15 个平行样中，设计取样时间：0 d、1 d、2 d、4 d、6 d、9 d、12 d、15 d、19 d、24 d、30 d，45 d、60 d、75 d、90 d 共15 个取样时段。每个时段所取样品，同一样品留样5 份准备检测用，每份留样50 g左右，留样后先放冰箱冷冻，其中4 份统一送往四川成都生物科学院，分析在窖泥培养中加入不同菌种对窖泥发酵过程中微生物区系的变化和特征。其余四分检测其他指标。

1.2 检测方法

1.2.1 检测仪器及试剂

安捷伦7890A-5975C 气质联用仪；日本岛津GC-2014 色谱仪；上海博弈数显鼓风干燥箱；pH 酸度计、低温离心机、可见风光光度计、液相色谱等；斐林试剂，氢氧化钠，磷酸缓冲溶液等。

1.2.2 常量成分分析测方法

窖泥中水分、有机质、有效磷、氨态氮和pH 值等常量指标分析按照河套酒业QJ/NHJD.01.3-2011窖泥分析方法检测。

1.2.3 微量成分分析方法

窖泥中代谢产物分析，如乙酸、丁酸和己酸等酸类物质采用气相色谱填充柱分析；正丙醇、正丁醇等醇类，己酸乙酯、乙酸乙酯等四大酯类物质，利用气相色谱法毛细柱分析。

样品前处理方法：准确称取一定量窖泥样品，加入65%vol的乙醇溶液，冰浴浸提，低温离心后过滤膜，滤液上气相色谱法毛细柱测定醇类和酯类物质。酸类物质需要用甲酸酸化后上气相色谱填充柱测定。

气相色谱填充柱分析条件：使用2 m 测酸定制填充柱，柱温130 ℃保持12 min，以20 ℃/min 速率升温到170 ℃，保持10 min，以20 ℃速率升温到180 ℃；进样口、检测器温度190 ℃；载气高纯氮气，载气流量30 mL/min 保持17 min，以5 mL/min 升到50 min。

采用外标法，配制200 mg/100 mL 乙酸、丙酸、丁酸和己酸混标，配制10 mL，用50 %乙醇溶液定容，待用。

气相色谱毛细柱分析条件：使用50 MC×0.25 mm的CP—Wax57CB柱，高纯氮气为载气，流速1.8 mL/min，尾吹气约30 mL/min；毛细柱分流比33∶1；起始柱温35 ℃，保持4 min，以5 ℃/min 升温至120 ℃，保持15 min，再以10 ℃/min 升温至230 ℃，保持10 min。进样口温度为230 ℃，检测器温度为240 ℃。

1.2.4 高通量测序方法

试验通过Realtime PCR 实时荧光定量的方法对样本16S 基因(Weimer,2012)进行定量。

1.2.4.1 引物

引物分别为CloKly1F/CloKly1R（CloKly1F，5'-GAGGAGCAAATCTCAAAAACTGC-3'；CloKly1R,5'-CCTCCTTGGTTAGACTACGGACTT-3'）。

1.2.4.2 Realtime PCR 体系

Realtime PCR体系为25μL。SsoFast TM EvaGreen ® Supermix 12.5 μL；CloKly1F 1 μL；CloKly1R 1 μL；DNA 2 μL；ddH2O to 25 μL。所有样本进行3次技术重复。

1.2.4.3 PCR扩增程序

98 ℃预变性30 s，1 个循环；95 ℃变性5 s，59 ℃退火5 s，72 ℃延伸5 s，40 个循环；1 step 溶解曲线信号采集。荧光数据采集在延伸结束时进行。实时荧光定量PCR 在Bio-Rad Opticon2 荧光定量PCR 仪上进行。

2 结果与分析

2.1 窖泥培养过程中的理化指标

2.1.1 常规指标

窖泥的常规指标包括水分、有机质、有效磷、氨态氮、速效钾、pH值、总酸和乳酸等8项指标。选择3 个方案中理化指标存在明显差别的指标进行分析。有机质、有效磷、氨态氮和乳酸共4项在3个方案中随着培养发酵时间的延长存在明显的差异，对这3项指标进行具体分析。

2.1.1.1 有机质随时间的变化曲线

有机质，一般用于生物领域,狭义的是指所有可以被生物(包括微生物和植物酶)分解的有机物。窖泥中有机质含量与微生物的生长、繁殖有着密切的联系。有机质的主要组成部分腐殖质及其分解产物是己酸菌等微生物的主要养分，能帮助增加让水分进入的空隙，改善窖泥在发酵过程中的失水环境，还可以缓解乳酸钙、乳酸铁的形成，避免窖泥的板结退化，所以根据窖泥中有机质的含量高低可以判断窖泥的优劣[1]。

对3 个方案窖泥样品有机质进行分析，有机质随培养老熟的时间的变化，分析时对每个方案每个样品检测3次的数值求取平均值后进行分析。

由图1 可知，窖泥的有机质随时间的变化规律，3 个方案有机质起始值差别不大，数值在6%～7 %范围之内，0～90 d 整体呈现出缓慢降低趋势。在整个窖泥老熟的过程中，除个别发酵时间点，克氏方案的窖泥有机质在发酵期任意发酵培养时间均略高于其他两个方案。在培养结束时，克氏方案窖泥的有机质仍然高于对照和复合方案窖泥的有机质。在整个窖泥的培育与老熟的过程中，克氏方案窖泥有机质整体降低幅度是最小的。说明添加克氏梭菌菌种和制窖泥并且培育老熟，对于增强窖泥疏松肥沃程度、提高窖泥的蓄水能力、减少由于失水而导致的窖泥老化问题以及减缓窖泥在后期发酵中老化速度等方面均有促进的作用，同时为保证微生物正常生长和代谢提供了基础条件。

图1 不同方案窖泥样品的有机质随时间的变化曲线图

2.1.1.2 有效磷随时间的变化曲线

有效磷，是能被己酸菌等微生物及时吸收利用的磷素，进入细胞后迅速同化为含磷化合物质。窖泥中加入含磷物质，以及和制窖泥所用土壤中含有的微量磷元素，是保证生物及微生物吸收的磷素来源。

由图2 可知，3 个窖泥方案的有效磷变化规律基本一致，从0～90 d呈现出逐渐降低的变化规律，说明在窖泥发酵老熟过程中有效磷降低；3 个方案有效磷起始值在1000 mg/kg 左右，克氏方案有效磷最低，对照和复合比较接近，有效磷在1～4 d 时克氏居于对照和复合之间，且复合高于对照，从第6天开始到培养发酵结束，克氏方案有效磷高于对照和复合。在窖泥发酵培养老熟过程有效磷趋于降低的前提下，克氏方案有效磷降低幅度相对较小。

图2 不同方案窖泥样品的有效磷随时间的变化曲线图

2.1.1.3 氨态氮随时间的变化曲线

窖泥中氨态氮是能被己酸菌等微生物利用的含氮物质，能为微生物生长繁殖代谢提供必须的氮源，是组成己酸菌细胞内蛋白质和核酸的重要元素，是微生物生命活动中不可或缺的物质。

由图3 可知，对照和复合方案窖泥的氨态氮变化规律基本一致，克氏方案窖泥的氨态氮和对照、复合略有不同。总体来看，3 个方案窖泥的氨态氮随培养时间的延长都呈现出不同程度的升高趋势。3个方案氨态氮起始值基本相同，在40 mg/100 g 干土左右，氨态氮0～4 d基本保持不变。对照和复合方案的窖泥氨态氮随着发酵时间的延长从6 d 到15 d 迅速升高，升高到100 mg/100 g 干土以上，15 d到培养结束呈现出降低、升高、再降低、再升高的趋势。克氏方案窖泥氨态氮从第9 天到12 天略有升高但幅度不大，12 d 到45 d 属于迅速升高阶段，最高为140 mg/100 g 干土，45 d 到培养结束，经历下降再升高。培养结束后氨态氮克氏高于对照高于复合。

图3 不同方案窖泥样品的氨态氮随时间的变化曲线图

2.1.1.4 乳酸随时间的变化曲线

由图4 可知，3 组窖泥乳酸随时间的变化规律基本一致，呈现先升高后降低的变化趋势。总体来看，3 组方案窖泥从开始发酵到培养结束，乳酸值平均降低5～8 g/kg。发酵起始3 组窖泥乳酸值克氏和复合相同，低于对照。随发酵时间的延长克氏方案窖泥乳酸值变化比较简单，0～2 d 时乳酸迅速升高，在第2 天到达最高值，14 g/kg 左右；从第2 天到第9 天又迅速降低到1 g/kg 左右，第9 天到培养结束，乳酸一直保持在1.38 g/kg，后期的发酵基本稳定。对照和复合窖泥乳酸值在发酵过程中变化比较复杂，大致为先升高后降低之后又升高再降低，呈现出锯齿形的变化规律，其中复合窖泥乳酸在发酵第9 天达到最大值为18 g/kg，对照在第2 天出现最高值为12 g/kg，以锯齿形变化直到发酵30 d，对照和复合均降低至最小值2 g/kg 左右，发酵结束后，对照和复合乳酸值基本相等。在发酵结束后，乳酸值克氏最低，复合中间，对照最高。

图4 不同方案窖泥样品的乳酸随时间的变化曲线图

在人工窖泥配制的过程中，在物料以及和制过程中空气中会存在大量的产酸菌，也会存在利用乳酸的微生物群类，使得乳酸含量变化趋势具有一定的规律性。本实验中，发酵前期产乳酸的微生物占主导地位，使得乳酸大量生成，后期乳酸利用菌有占主导地位，将前期合成的乳酸利用或分解，两种作用达到平衡，使得人工培育窖泥乳酸保持在稳定的水平。河套地区的土壤呈盐碱性，在和制窖泥使用的土壤中，存在含量较高的铁、钙、镁等离子或化合物，培育好的窖泥在窖池中长期与乳酸作用会逐渐形成乳酸亚铁以及乳酸钙等物质，在乳酸菌生长繁殖中存在明显的阻碍作用。乳酸亚铁与乳酸钙的长期积累是窖泥老化的主要原因[2]。所以在做窖泥时应注意土壤中的铁、钙含量，注意在发酵培养时产生适量的乳酸，要考虑到延缓窖泥的老化情况。

2.1.2 微量指标

3个方案的窖泥样品按照样品前处理方法处理后，采用测酸定制填充柱和毛细柱同时分析窖泥样品中的微量成分。根据分析结果统计发现窖泥中正丙醇和正丁醇等醇类物质，己酸和丁酸等酸类物质含量较高并规律性较强，做统计分析；窖泥中酯类和其他一些微量成分含量较小并且规律性不强，不做具体分析总结。

2.1.2.1 醇类指标

醇类物质是窖泥培养代谢产物的第三大类物质[3]。窖泥在培养过程中会产生一些含量颇高的杂醇油物质比如正丙醇和正丁醇。杂醇油是不可缺少的香气成分之一，与有机酸结合成酯，使白酒具有独特香气，若含量过高与酸酯比例不协调，则成为白酒的异杂味，长期饮用杂醇油含量较高的白酒，会对人体造成严重损害[4]。白酒生产企业控制白酒中杂醇油要尽量使用产杂醇油含量较低的发酵酿造物料如窖泥。在窖泥发酵培养的过程中要保持较低含量的杂醇油。通过对3 个方案检测数据的整理统计，正丙醇和正丁醇分别采用均值来分析，具体分析见图5。

由图5 可知，3 个方案的窖泥样品在整个发酵过程，正丙醇的变化规律是一致的，基本是先缓慢上升再略微下降的趋势；3 个方案正丙醇起始值相同，0～30 d 均呈现缓慢升高的趋势，并且在这一过程中ks 方案的正丙醇一直处于较低水平，ds 和fh差别不大，0～30 d 正丙醇ds＞fh＞ks，30～90 d 均呈现出降低升高又降低的变化趋势，一直到培养结束，正丙醇含量存在ds＞fh＞ks 规律。3 个方案在整个发酵过程中，克氏方案产生的正丙醇含量最少，说明在和制窖泥时添加克氏梭菌培养发酵会或多或少抑制正丙醇的产生。

图5 不同方案窖泥样品的正丙醇随时间的变化曲线图

由图6 可知，3 个方案窖泥的正丁醇随时间的变化先升高后降低。3个方案窖泥正丁醇含量初始值均为0，说明在和制新泥使用的物料中均不含正丁醇。0～9 d 3 个方案正丁醇缓慢上升，微生物代谢产生正丁醇能力较弱，此时正丁醇含量fh＜ks＜dz。在窖泥发酵第9 天ks 的正丁醇迅速升高，12 d达到最大值50 mg/100 g，fh 的正丁醇在发酵第24天达到峰值为46.1 mg/100 g，dz 在窖泥发酵第60天达到峰值为59.6 mg/100 g。正丁醇含量的高低受制于正丁醇产生菌和正丁醇代谢菌的相互协同作用。Ks 在窖泥发酵前期，fh 在发酵中期，dz 在发酵后期均产生较高含量的正丁醇，说明在这个区间，以代谢产生正丁醇为主的细菌较为活跃。之后以正丁醇为底物分解代谢的细菌占主导或抑制生成正丁醇的细菌较为活跃，使得正丁醇保持在一定的水平。发酵结束后，正丁醇含量ks＜fh＜dz，说明添加克氏梭菌发酵培养老熟窖泥和降低窖泥中正丁醇的含量，两者关系为正相关。

图6 不同方案窖泥样品的正丁醇随时间的变化曲线图

2.1.2.2 主要酸类指标

窖泥中大量的产酸菌在培养窖泥的过程中，代谢产生乳酸、己酸、乙酸和丁酸等含量较高的有机酸，可以说酸类物质是窖泥培养代谢产物的第一大类物质。本文微量成分中酸类物质的分析主要是针对己酸和丁酸。3个方案窖泥样品的酸类物质以丁酸和己酸均值和培养发酵时间分析，结果见图7。

由图7可知，3个方案窖泥的丁酸值在整个发酵过程中，变化趋势基本一致，随着发酵时间的延长呈现出缓慢的升高趋势。发酵开始时3个方案均存在少量的丁酸值且略有不同，这是由于在和制窖泥的时候，所用黄水、菌液等物料中含有丁酸，物料没有和制均匀或物料所含丁酸含量不同，会造成发酵开始时丁酸存在并且含量不同。在发酵前期3个方案丁酸含量略有差别。0～4 d时，ks 和fh 方案窖泥的丁酸含量缓慢降低，这是由于和制窖泥用到的土壤和其他物料中存在瘤胃菌科（Ruminococcaceae）等一类梭菌，它可以将乳酸氧化合成乙酰辅酶A，并释放出能量NADH，这类微生物通过碳链延长过程，在丁酰辅酶转移酶等一系列酶的催化下，将乙酰辅酶A 与乙酸进行缩合，合成丁酸，再经己酰辅酶A 转移酶等的催化作用，将乙酰辅酶A 与丁酸缩合合成己酸，在这个过程中会消耗物料引入的丁酸、乳酸等物质，同时会伴随着己酸含量的增加。巴克氏认为己酸菌将乙醇及丁酸转化为己酸时，必须先有丁酸菌将乙醇和乙酸合成丁酸，即先有丁酸的发酵，也就是说丁酸的累积有利于己酸菌将丁酸转化为己酸[5]，通过实验得到的结论和理论相符。在发酵4～15 d 丁酸迅速升高，15 d 之后平稳缓慢地增加，发酵后期3 个方案的丁酸值fh 和ks 略高于dz，区别不大，整体来看是一个丁酸积累的过程。

窖泥的发酵老熟其实是微生物的发酵过程，当发酵过程中碳源比例过高时，有机物通过糖酵解途径生成大量丙酮酸，一部分进入三羧酸循环用于微生物自身生长，另一部分进入其他代谢途径生成乙酸、乳酸和乙偶姻等代谢产物，出现碳溢流代谢(carbon overflow metabolism，COM)现象。丁酸梭菌在发酵过程中也存在碳溢流代谢现象，COM 现象也会积累大量丁酸、乙酸等[6]。

由图8 可知，在发酵开始时，3 个方案均存在不同含量的己酸，这也是由于物料因素引起的。整个发酵过程中3 个方案窖泥的己酸值，ks 和fh 己酸随时间的变化规律基本一致，先升高后降低然后再次缓慢升高，0～4 d 己酸升高，这一现象和丁酸分析时结论相符，4～15 d 缓慢降低，15 d 到发酵结束，己酸处于缓慢平稳升高的状态。dz 在发酵前期己酸值变化规律恰好另两个方案相反，0～6 d 己酸降低，从第6 天开始到发酵结束，一直缓慢平稳的升高。3 个方案的己酸在发酵后期变化规律基本一致，且均处于缓慢平稳的升高状态，但升高的幅度不是很大。

图8 不同方案窖泥样品的己酸随时间的变化曲线图

窖泥中存在大量的葡萄糖营养型等产己酸菌群，可利用丁酸作为其合成己酸的前体物质[7]。这一类微生物代谢产生己酸是从乙酸到丁酸再到己酸的碳链延长过程，所以在相同的酶水平状态下，代谢产生己酸是一个缓慢的过程，需要长时间的积累。

2.2 微生物群落组成与多样性分析以及不同培养方式微生物群落结构演替规律

提取样品总DNA后，根据V3+V4区设计引物，合并引物接头，进行PCR 扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，文库质检合格后用IlluminaMiSeq PE300 测序。对样品原始测序序列进行过滤、双端拼接，得到优化序列（Tags），使用QIIME（version 1.8.0）软件中的UCLUST 对Tags 在97%的相似度水平下进行聚类，获得OTU，基于细菌分类学数据库对OTU 进行分类学注释，得到样品各分类水平上的物种分类信息，以下数据及分析均在属水平上进行。

2.2.1 不添加菌液培养窖泥过程中的微生物群落组成与多样性分析

图9 列出了不加菌液培养窖泥过程中属水平上排名前10的微生物类群。

由图9 可知，刚和制好的窖泥以芽孢杆菌为主（Bacillus，31.47 %），其他类群的比例均小于1 %。培养第1天，芽孢杆菌数量略有上升（38.71%），乳球菌的数量迅速增加（Lactococcus，24.89），肠球菌的数量也开始增加（Enterococcus，4.44 %），乳球菌和肠球菌均为兼性厌氧的乳酸菌，产生乳酸。这些菌的繁殖可消耗体系中的氧气，同时乳酸菌繁殖产生的乳酸降低了体系中的pH值，两方面的作用使不耐酸、不耐缺氧的芽孢杆菌数量逐渐下降，至发酵第6 天时相对丰度降到了10%以下。耐酸、耐缺氧的厌氧菌开始繁殖，Clostridium_1发酵第1 天开始增殖，发酵第6 天达到最大值（36.02 %），Clostridium_12（通常认为的己酸菌克氏梭菌属于此类群）发酵第2 天即达到较高数量（16.72%），在整个发酵期均维持较高的数量，相对丰度均大于1 %。厌氧芽孢杆菌在发酵第9 天至第30 天均维持较高的水平（大于5 %）。Caproiciproducens（一种能利用半乳糖醇产己酸的细菌）在发酵第6 天开始大量繁殖，在整个发酵期均占有较大比例，发酵15～75 d 其相对比例均占到20%以上。肠球菌在发酵第6天后数量下降，另一种乳酸菌乳芽孢杆菌（Sporolactobacillus）数量增加，至第15 天时相对丰度达到23.06%。至发酵第90天，窖泥中相对比例大于1 %的微生物属均为厌氧或兼性厌氧类群，包括Caproiciproducens（10.10 %）、Escherichia-Shigella（9.46 %）、厌氧孢杆菌（2.56 %）、乳芽孢杆菌（2.51%）、Clostridium_1（2.93%）等。

图9 不加菌液培养窖泥过程中主要微生物相对丰度（属水平，%）

2.2.2 添加克氏菌液培养窖泥过程中的微生物群落组成与多样性分析

图10 列出了加克氏梭菌培养窖泥过程中属水平上排名前10的微生物类群。

由图10 可知，刚和制好的窖泥以芽孢杆菌（Bacillus，16.99%）、Clostridium_12（9.66%）和乳杆菌（Lactobacillus，4.94%）为主，其他类群的比例均小于1 %。发酵90 d 的窖泥以Caproiciproducens（22.97 %）、Escherichia-Shigella（7.58 %）、乳球菌（Lactococcus，2.41 %）、Clostridium_1（1.47 %）和乳杆菌（Lactobacillus，1.16%）为主，其他类群的相对丰度均小于1%。芽孢杆菌在发酵第1 天和第2 天大量增殖，之后数量逐渐下降，到第90 天时，相对比例为0.9 %。Clostridium_12 在发酵第1 天到第2天时因为其他菌的生长相对比例下降，之后开始繁殖，第4 天时相对比例达到最大，之后又逐渐下降，第9 天后基本稳定在相对比例1%左右。乳杆菌在第12 天之前相对比例基本上无变化，第15 天时比例迅速增加到21.14%，之后又迅速下降，19 d 时相对丰度仅为3.04 %。培养第1天，乳球菌（Lactococcus）和瘤胃杆菌Rummeliibacillus的数量迅速增加到23.56 %和19.77 %，二者均为兼性厌氧菌。Rummeliibacillus耐乙醇，能产生乙醇、乙酸乙酯、乙偶姻等代谢产物，该属菌在发酵第2 天后比例开始下降，第4 天开始，比例降到1%以下。乳球菌属于乳酸菌，能产生乳酸，该类群在发酵前期比例均较高，第6 天之前比例大于30 %，第9～15 天相对丰度在10 %以上。乳杆菌和乳球菌均为乳酸菌，可产生乳酸。体系中还存在另一类乳酸菌——芽孢乳杆菌，该类群在初始窖泥中比例不高，但培养第1 天相对丰度即开始增加，到第6 天时达到23.58%，直到第30天，相对比例均在15%以上，之后逐渐下降，90 d 时相对丰度为0.96%。Clostridium_1 从发酵第1 天开始增殖，到发酵第12 天时相对丰度达到12.57%，之后逐渐下降，45～90 d 时稳定在1%左右。

2.2.3 添加复合菌液培养窖泥过程中微生物群落组成与多样性分析

图11 列出了加复合菌液培养窖泥过程中属水平上排名前10的微生物类群。

由图11 可知，刚和制好的窖泥以芽孢杆菌（Bacillus，30.82 %）、Clostridium_1（13.79 %）、Clostridium_15（4.88 %）、Clostridium_12（3.17 %）、乳杆菌（Lactobacillus，2.88 %）和魏斯氏菌（Weissella，2.78 %）为主，其他类群的比例均小于1 %。发酵90 d 的窖泥相对丰度大于1 %能定性的类群仅有Escherichia-Shigella（8.30 %）和乳杆菌（Lactobacillus，3.04 %），其他能定性的类群比例均小于1 %，此外还有较多数据库不能比对的厌氧菌类群的相对丰度大于1%。芽孢杆菌在培养第1 天相对丰度即开始迅速下降，到第90 天时，相对丰度为0.36%。Clostridium_1 在培养第1 天相对丰度迅速下降，直到第45 天开始增殖，相对丰度达到6.60%，第90 天时相对丰度仍维持在较高的水平。Clostridium_12和Clostridium_15 的变化规律相似，均为培养初期下降，第12 天时比例增加，之后又下降，第24 天时比例上升，之后又下降，第45 天时回升，之后又下降，到第90 天时，比例已低于1%。乳杆菌在整个培养过程中相对丰度较稳定，均维持在1 %～10 %。魏斯氏菌(乳酸菌)初期丰度虽然较高，但在整个培养过程中比例没有太大的增加，第6 天后开始下降，到第90 天时已低于1%。乳球菌在发酵第1 天相对丰度迅速增加，第1 天到第4 天相对丰度均在25%左右，之后开始下降，到第90 天时低于1 %。芽孢乳杆菌初始时比例较低，第4 天时开始增加，第6 天到24 天时比例均在20%以上，之后开始下降，第90天时低于1%。

图11 加复合菌液培养窖泥过程中主要微生物相对丰度（属水平，%）

2.3 3 个方案窖泥培养过程中微生物群落结构演替规律

2.3.1 培养初期样品

3 种样品中芽孢杆菌均为丰度最大的类群，窖泥以黏土为材料，芽孢杆菌是土壤中的主要微生物类群。加克氏梭菌组初始体系中Clostridium_12 的比例较高，克氏梭菌属于Clostridium_12 类群。乳杆菌的相对丰度较高异常，推测是否在克氏梭菌菌液培养过程中伴生了乳杆菌的增殖。加复合菌液组初始体系中微生物类群相对较丰富，大于1%的类群有6个，芽孢杆菌主要来自于土壤，其他的类群应该均来自于复合菌液，包括了厌氧的Clostridium_1、Clostridium_12和Clostridium_15 及兼性厌氧的两类乳酸菌（乳杆菌和魏斯氏菌），表明在复合菌液的扩大培养过程中有可能也伴随着乳酸菌的扩大培养。

2.3.2 培养过程样品

3种样品均以芽孢杆菌和乳酸菌的繁殖为起始发酵动力。芽孢杆菌中的大多数类群为好氧菌，生长迅速，芽孢杆菌的繁殖可以消耗体系中的氧气，为厌氧菌的繁殖提供条件，部分芽孢杆菌发酵糖后可以产酸，降低体系的pH，抑制有害微生物的生长繁殖。随着发酵的进行，体系中氧气减少，厌氧菌繁殖，芽孢杆菌生长受到抑制，相对比例逐渐降低。3种样品中复合菌液组芽孢杆菌的比例下降最快，可能是因为添加的复合菌液体系中厌氧菌和兼性厌氧菌的比例相对更高，厌氧菌起始生长的速度更快，芽孢杆菌的生长更早被抑制。

乳酸菌是中国传统发酵食品中的重要微生物，在窖泥培养过程中同样起着重要的作用。乳酸菌为兼性厌氧菌，在有氧和缺氧环境中均能生长，乳酸菌产生的乳酸可降低体系的pH值，还具抑菌作用，这些特性对抑制有害微生物生长、净化酿造环境非常重要。3 种样品均从第1 天开始就有乳酸菌迅速繁殖，第6 天以前主要是乳球菌的快速增殖，6 d 以后是乳杆菌、芽孢乳杆菌的增殖，所有乳酸菌在培养后期相对比例均下降，不加菌液组下降最快，15 d后所有乳酸菌的比例均下降到5%以下，加克氏梭菌和加复合菌液组的芽孢乳杆菌均在45 d后下降到5%左右。6～24 d之间，复合菌液组芽孢乳酸菌的相对比例比其他两组高，反映在乳酸产量上，复合菌液组在培养6～24 d 期间乳酸含量高于其他两组。芽孢乳杆菌为兼性厌氧菌，产生芽孢，最适生长温度37 ℃（这可能也是其在培养中期阶段仍能保持较高比例的原因），能产生D-乳酸，鲁少文等[8]在人工窖泥培养过程中发现芽孢乳杆菌在窖泥培养不同时期均为优势微生物属，关于该属菌株在窖泥中的作用还需要进一步研究。

通常认为的己酸菌克氏梭菌（属于Clostridium_12类群）在3种处理中均有分布，但演替规律存在差异。不加菌液组初始体系中Clostridium_12 类群比例较低，发酵第2 天即迅速增加，第6 天开始下降，但整个培养过程一直维持较高水平，相对比例均大于1 %。加克氏梭菌组初始体系中Clostridium_12类群比例在3组中最高，起始生长慢，发酵第4 天相对比例增加，第6 天后又开始下降。复合菌液组Clostridium_12 的波动幅度更大，起始生长较慢，第12 天时达到培养初期相对比例的最大值，15～19 d 时比例迅速下降，19 d 后又回升，24 d 时达到3 组处理中Clostridium_12 相对比例的最大值，之后又迅速下降。

培养过程中还检测到另外一类产己酸的类群Caproiciproducens，该属菌能利用半乳糖醇产生己酸，有研究表明在分析不同窖泥的微生物种群结构时发现优质窖泥中这属菌的比例较高。不加菌液组在9 d 后该类菌的比例迅速增加，30 d 时相对比例近50 %，30～75 d 的相对比例均在20 %以上。加克氏梭菌组该类菌生长的速度稍慢，24 d 之前相对比例增加的幅度较小，24 d 后迅速增加，30 d 时相对比例达40 %，之后整个培养期一直保持大于20%的比例。复合菌液组该类菌生长的速度最慢，相对比例也最小，30 d 时相对比例为2.09 %，45 d时相对比例达最大值15.44 %，60 d 后相对比例下降较快，90 d 时小于1%。可能窖泥中其他厌氧菌的繁殖会抑制Caproiciproducens的生长，但未分离到这类菌，无法进行验证。

2.3.3 培养结束样品

3种样品中芽孢杆菌的丰度均比初始状态降到了1 %以下，体系中均以厌氧或兼性厌氧菌为主，均包括许多未鉴定或未培养菌（因没有菌名，表1、表2、表3 均未列出未鉴定或未培养菌），复合菌液组厌氧未鉴定或未培养菌的种类和数量相对更高。不加菌液组相对比例大于1 %的有8属，丰度最高的是Caproiciproducens（10.10 %）。克氏梭菌组相对比例大于1%的有5属，丰度最高的也是Caproiciproducens（22.97 %）。复合菌液组相对比例大于1 %的有3属，丰度最高的是Escherichia-Shigella（8.30%）。乳酸菌在3种样品中均占有一定比例，相对丰度在5%左右。

3 结论

3.1 理化方面

窖泥培育中添加功能菌液，窖泥质量优于不加任何菌液的。在本实验理化指标中体现较为明显，克氏方案有机质、有效磷和氨态氮高于对照和复合，说明克氏组消耗有机质和有效磷较少，使得克氏组有较强的营养物质保留能力和蓄水能力，利于营养物质的可持续利用，更有利于保证窖泥的肥力和缓冲性能，使得窖泥在后期的发酵中老化速度减慢；在整个发酵过程中添加克氏梭菌的方案乳酸相对较低，较低的乳酸在窖泥使用中会降低乳酸钙和乳酸铁的形成，延缓窖泥的老化，同时会抑制正丙醇、正丁醇等杂醇油的产生；对于己酸和丁酸等微生物代谢物质规律不明显。

3.2 微生物方面

无论是否加菌液，窖泥的培养均以芽孢杆菌和乳酸菌启动，为厌氧体系的形成提供了经济高效的模式。加克氏梭菌或复合菌液培养，起始克氏梭菌的数量更高，但培养90 d 后克氏梭菌的相对比例并不高于不加菌液培养的窖泥。窖泥中还存在其他相对比例更高的产己酸菌，比如Caproiciproducens、Megasphaera埃氏巨球型菌、Ruminococcus_1瘤球菌1。3 组在发酵过程均出现放线菌，克氏组比例高于对照和复合，己酸菌和放线菌具有协同促进生长的作用，种类较多的放线菌可结瘤固氮，为窖泥己酸菌提供丰富的有机氮，增强窖泥肥力。同时还存在其他的厌氧菌影响窖泥的质量。

培育中的窖泥微生态系统是由己酸菌、丁酸菌、甲烷菌、乳酸菌、硫酸盐还原菌和硝酸盐还原菌等多种微生物组成的微生物共生群落系统，该微生物群落随发酵时间的不同，导致窖泥的化学生态不同,菌类菌种呈现明显的区别。窖泥的培育过程是一个典型微生态群落的演替过程和各菌种间的共生、共酵、代谢调控过程，该过程不但对微生态群落中的菌种演替具有反馈抑制作用，而且会体现到窖泥的理化以及感官上，直接影响窖泥的质量。