张赟赟，巫 凯，严 赟，郭雯雯，黄 莉，王彩玉

（1.广西中医药研究院，广西 南宁 530022；2.广西食品药品检验所，广西 南宁 530021；3.桂林医学院，广西 桂林 541004）

网络鸡血藤根是豆科植物网络崖豆藤Milletia reticulataBenth 的干燥根，味苦，有毒，分布于我国西南、华东、华中、华南等地区，具有祛风除湿、通经活络、强筋骨、镇静功效。该药材为广西瑶族传统习用药材，多用于外治风湿筋骨痛、四肢麻木、腰膝酸痛、瘫痪、跌打损伤等病症［1-2］。瑶药由于无科学、系统、规范的法定质量标准，很多具有民族医药特色的药材及药方不能直接进行成药、制剂开发，导致临床应用受限。近年来，地方政府多次组织了广西常用民族药、瑶族民间用药、瑶药资源普查及开发利用研究等大量基础性工作，初步制定了瑶药的范畴和质量标准体系。本研究中拟建立网络鸡血藤根的质量控制标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

2695 - 2489 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；BX41 型高分辨生物显微镜（日本Olympus 公司）；SM2010R型平推式切片机（德国Leica公司）；LT9/11型马弗炉（德国Nabertherm 公司）；ED240 型干燥箱（德国Binder 公司）；HEIZBAD HRT - VAP 型旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；IQ7000型超纯水仪（美国Millipore公司）；XS205DU 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为十万分之一）；S120H 型超声波清洗仪（瑞士Elma公司）。

1.2 试药

芒柄花素对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111703-200501，含量99.1%）；硅胶G 薄层板（青岛海洋化工有限公司）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为高纯水。10 批网络鸡血藤根药材样品，均产自广西（见表1），经广西中医药研究院黄云峰副研究员鉴定为正品。部分2 号药材样品被制成腊叶标本，经广西中医药大学中药教研室韦松基教授及广西中医药研究院中药室赖茂祥研究员和黄云峰副研究员鉴定为正品，以其作为网络鸡血藤根对照药材。

表1 药材样品信息Tab.1 Information of medicinal material samples

2 方法与结果

2.1 性状鉴别

药材样品呈圆柱形，表面灰褐色，具细皱纹及栓皮脱落痕，直径0.5～5.0 cm。质硬，难折断，断面颗粒状，皮部薄、灰褐色，木部黄白色，有细密的放射状纹理，无髓。商品常切成斜片（厚约0.5 cm），气微，味淡。详见图1。

图1 网络鸡血藤根药材外观图A.Overall picture B.Cross sectionFig.1 Appearance of Millettiae Reticulatae Radix

2.2 显微鉴别

横切面：木栓层为数列排列整齐的扁方形或方圆形细胞。皮层窄，细胞圆形或类圆形，石细胞为数个一群且呈断续环状分布，细胞壁较厚，孔沟明显。韧皮部较宽，细胞类圆形或不规则形，韧皮纤维为数个一群且呈散在分布，纤维壁较薄，非木化或微木化，周围的薄壁细胞有的含有草酸钙方晶且形成晶纤维，有的含淀粉粒。木质部较宽，由导管、木纤维和木薄壁细胞组成，木纤维和木薄壁细胞相间排列，导管单个或多个相连，呈放射状分布，直径30～185µm，木射线细胞2～8 列。详见图2。

图2 网络鸡血藤根药材横切面显微图A.Cross section B.Phellem and sclerotic cell C.Starch grain in xylem ray D.Phloem（xylem ray and crystal fiber）E.Xylem（vessel，xylem ray and wood fiber bundle）Fig.2 Cross-section micrograph of Millettiae Reticulatae Radix

粉末：棕黄色。纤维成束或分离，先端圆钝或折断，部分纤维周围的薄壁细胞含有草酸钙方晶形成晶纤维，纤维直径12～33µm。石细胞为单个或多个相连，细胞壁较厚，孔沟明显，直径20～55µm。草酸钙方晶呈方形或不规则形，直径9～35µm。淀粉粒为散在或存在于薄壁细胞中，单粒或复粒，圆形、半圆形或鸡嘴形，脐点点状或裂缝状，直径5～15µm。导管为具缘纹孔导管，直径22～118µm。木栓细胞呈类方形或多角形，棕黄色或灰白色，细胞壁较厚。详见图3。

图3 网络鸡血藤根药材粉末显微图A.Crystal fiber B.Calcium oxalate square crystal C.Starch grain D.Sclerotic cells E.Duct F.Cork cellsFig.3 Micrograph of the powder of Millettiae Reticulatae Radix

2.3 薄层色谱（TLC）鉴别

取药材样品粉末2 g，加甲醇30 mL，超声（功率200 W，频率37 kHz；下同）提取30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。取对照药材粉末2 g，同法制成对照药材溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC 法，吸取上述溶液各2µL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以氯仿- 丙酮- 甲醇- 氨（6∶3∶0.5∶0.1，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色斑点。详见图4。

图4 薄层色谱图1，3-10.Test solution 2.Reference medicinal materials solutionFig.4 TLC chromatograms

2.4 水分、灰分、浸出物检查

水分：按2020 年版《中国药典（四部）》通则0832 第二法烘干法测定。结果药材样品含水量为3.07%～9.98%，平均7.01%。详见表2。

总灰分：按2020 年版《中国药典（四部）》通则2302灰分项下总灰分测定法测定。结果药材样品中总灰分含量为2.47%～4.69%，平均3.39%。详见表2。

静电分离法是70年代兴起的液固分离技术，原理是当油浆流经填料床层时，催化油浆中的固体微粒在高压电场作用下被极化带上电荷，从而被填料吸附，达到净化油浆的目的。最早的静电分离器是由美国的海湾石油公司设计研发制造，美国的阿瑟港石油公司用于工业应用。之后国内很多研究机构做了大量的研究和技术改进，赵娜[3]等人在Caoqing[4]，Abidin[5]等人的研究基础上自制静电分离装置，通过三级静电分离对重油催化油浆的固体颗粒物脱除率高达99%。虽然静电分离法脱除率高，但该法对10μm以下的颗粒物分离效果显著，且所需设备复杂，分离效果受油浆性质、操作条件影响，因此在我国还未实现工业应用。

酸不溶性灰分：按2020 年版《中国药典（四部）》通则2302 灰分项下酸不溶性灰分测定法测定。结果药材样品中酸不溶性灰分含量为0.16%～0.59%，平均0.31%。详见表2。

表2 药材样品水分、灰分、浸出物含量测定结果（%）Tab.2 Results of the content determination of moisture，ash and extract in medicinal material samples（%）

浸出物：按2020 年版《中国药典（四部）》通则2201 项下的热浸法（以水为溶剂）测定。结果药材样品中浸出物含量为9.06%～23.20%，平均16.45%。详见表2。

2.5 含量测定

2.5.1 色谱条件

色谱柱：RP- 18 Endcapped 柱（250 mm × 4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸水溶液（32∶68，V/V）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：249 nm；柱温：30 ℃；进样量：20µL。

2.5.2 溶液制备

取芒柄花素对照品9.96 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容，摇匀，即得质量浓度为0.098 7 mg/mL 的对照品溶液。取药材样品粉末（过2 号筛）约3 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入100 mL甲醇，加热回流30 min，放冷，摇匀，滤过，滤液减压浓缩至干，残渣加甲醇溶解并移至5 mL 容量瓶，用甲醇定容，摇匀，经0.45µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.5.3 方法学考察

图5 高效液相色谱图1.Formononetin A.Reference solution B.Test solutionFig.5 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密量取2.5.2 项下对照品溶液0.5，1，2，3，4，5，10 mL，置10 mL 容量瓶中，加流动相定容，摇匀，制成系列对照品溶液。精密量取20µL，按2.5.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以芒柄花素质量浓度（X，µg/ mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y= 122 430X-50 575.94（r=0.999 8）。结果表明，芒柄花素质量浓度在4.94～98.70 µg/ mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.5.2 项下对照品溶液（2 号样品）适量，按2.5.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果，芒柄花素峰面积的RSD为0.16%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.5.2项下供试品溶液（1号样品）适量，分别于室温下放置0，2，4，8，14，22 h时按2.5.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，芒柄花素峰面积的RSD为0.71%（n= 6），表明供试品溶液在室温放置22 h内基本稳定。

重复性试验：称取样品（1 号样品）粉末适量，精密称定，各6 份，按2.5.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.5.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，芒柄花素的平均含量为50.61 µg/ g，RSD为1.27%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量样品（1 号样品）适量，共6 份，分别加入一定质量浓度的芒柄花素对照品溶液，按2.5.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.5.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果见表3。

表3 加样回收试验结果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.5.4 样品含量测定

取药材样品粉末各适量，分别按2.5.2项下方法制备供试品溶液，再按2.5.1 项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并计算样品含量。结果见表4。

表4 样品含量测定结果（µg/g，n=3）Tab.4 Results of the content determination of formononetin in samples（µg/g，n=3）

3 讨论

根据10 批药材样品水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物及芒柄花素含量测定结果，前四者以10 批药材样品数据中的最（大，小）值调整20%为限度值，含量以10批药材样品数据的平均值下调20%为限度值。建议网络鸡血藤根药材水分含量不得过12.0%，总灰分含量不得过6.0%，酸不溶性灰分含量不得过1.0%，浸出物含量不得低于8.0%，芒柄花素含量不得少于42µg/g。

TLC预试验中进行了耐用性试验考察，采用点状点样对自制板、预制板的展开效果，不同展开温度（5，35 ℃），以及不同相对湿度（30%，80%）进行考察。结果均表明本方法的耐用性良好。

由网络鸡血藤根指纹图谱前期研究可知其含有芒柄花素成分［3］。现代药理学研究表明，芒柄花素能促进脊髓损伤修复，促进骨再生，对股骨头坏死有治疗作用［4-5］，且能预防绝经期后女性和老年人骨质疏松［6］，这与其功能主治中的通经活络、强筋骨相适应。有研究表明，芒柄花素具有调血脂、对多种肿瘤有抑制作用及抗炎抑菌等作用［7-15］，故芒柄花素用于网络鸡血藤根药材质量评价具有一定意义。

综上所述，本研究中建立的标准可用于网络鸡血藤根药材的质量控制。