李英哲，李佳东，黄梦龙，周明哲，吴 弢

（上海中医药大学中药研究所，上海 201203）

菥蓂为十字花科植物菥蓂Thlaspi arvenseL.的干燥地上部分，又名析目（陕西）、苏败酱（江苏）、南败酱（湖北）、大荠、遏蓝菜、爪子草等，原产地为欧洲，现广泛分布于我国各地［1］。菥蓂始载于《神农本草经》，列为上品，其味辛、性微寒，归肝、胃、大肠经［2］，具有清肝明目、和中利湿、解毒消肿等功效，临床多用于目赤肿痛、脘腹胀痛、胁痛、肠痈、水肿、带下和疮疖痈肿等症的治疗［3］。菥蓂含黄酮类、有机酸类等化学成分［4］。目前，关于其质量控制的报道较少，2020 年版《中国药典（一部）》仅收录其薄层色谱（TLC）鉴别等项［3］。宋文静等［5］采用高效液相色谱（HPLC）法测定了菥蓂子药材中异牡荆素、当药黄素、黑芥子苷的含量。过立农等［6］、程丽媛等［7］分别建立了菥蓂药材饮片中7 种黄酮类成分的含量测定方法，而关于菥蓂配方颗粒的指纹图谱及含量测定尚未见报道。异牡荆素具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗肝纤维化、抗肿瘤、抗氧化及保护心血管系统和神经系统等作用［8-11］，与该制剂中的解毒消肿等功效相关。因此，本研究中以异牡荆素为指标成分，建立测定其含量的超高效液相色谱（UPLC）法，并采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC - MS/MS）法对制剂中的化合物进行指认，确定特征峰；在此基础上，建立其特征图谱，以为其质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290 Infinity Ⅱ液相色谱系统、Agilent 6546液相色谱四极杆飞行时间质谱仪（美国Agilent 公司）；Waters Acquity UPLC 超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；KQ250DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BP211D型万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；Milli - Q Academic 型纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 试药

菥蓂配方颗粒（编号为S1-S10，S12-S13，分别购自W 公司、S 公司、J 公司）；原儿茶酸对照品（批号为ST04100120）、柠檬酸对照品（批号为RS08641020）、丹参素对照品（批号为ST78460120），均购自上海诗丹德生物技术有限公司（含量≥98%）；当药黄素对照品（批号为DST200817 - 084）、大波斯菊苷对照品（批号为DSTDQ006301）、异荭草苷对照品（批号为DST200815-121）、木犀草素对照品（批号为DSTDM003201），均购于成都德思特生物技术有限公司（含量≥98%）；异牡荆素对照品（上海源叶生物有限公司，批号为B21544，含量≥98%）；荭草苷、芹菜素对照品（实验室自制，含量≥90%）；甲醇为分析纯，甲酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水；菥蓂药材饮片（编号为S11，购自W 公司），由上海中药标准化中心吴立宏研究员鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 试验条件

色谱条件：色谱柱为Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB - C18柱（100 mm × 4.6 mm，2.7 µm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～12 min 时10%A→40%A，12～12.5 min 时40%A→60%A）；流速为0.80 mL/ min；检测波长为336 nm；柱温为30 ℃；进样量为10µL。

质谱条件：正、负离子模式。干燥气温度320 ℃、流速8 L/min；雾化气压力35 psi；毛细管电压±3 500 V；碰撞电压175 V。一级质谱选用MS 1模式，质量扫描范围m/z100～1 700。二级质谱分别选用Target-MS/MS 和Auto - MS/ MS 模式，碰撞电压20，30，40 eV。采用Agilent MassHunter软件采集质谱数据。

2.2 溶液制备

取柠檬酸、丹参素、原儿茶酸、荭草苷、异荭草苷、异牡荆素、当药黄素、大波斯菊苷、木犀草素及芹菜素对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含各成分0.05 mg 的混合对照品溶液。取异牡荆素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含异牡荆素2.45 mg的对照品溶液。取颗粒样品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz；下同）处理30 min，放冷，用70%甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，即得颗粒供试品溶液。取药材饮片样品约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70% 甲醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷至室温，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得药材饮片供试品溶液。取麦芽糊精适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含糊精1.00 mg 的阴性对照品溶液。

2.3 菥蓂化合物指认

取2.2 项下药材饮片供试品溶液适量，按2.1 项下色谱条件调整流动相梯度比例（调整为0～10 min 时10%A→50%A）后进行分析。主要采用负离子模式（该模式更易识别黄酮类成分［11-12］）对菥蓂药材中的化学成分进行表征。共表征出14 个化合物（见表1），为排除同分异构体对质谱表征结果的影响，对其中10 个化合物（柠檬酸、丹参素、原儿茶酸、荭草苷、异荭草苷、异牡荆苷、当药黄素、大波斯菊苷、木犀草素及芹菜素）经对照品验证（见图1）。其中柠檬酸、丹参素、原儿茶酸及荭草苷为首次从菥蓂药材中检出。

表1 药材饮片样品主要化合物鉴定Tab.1 Identification of main compounds in Thlaspi Herba Formula Granules

2.4 UPLC 指纹图谱建立

2.4.1 方法学考察

专属性试验：取2.2 项下混合对照品溶液、颗粒供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。

精密度试验：取同一批颗粒供试品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。以异牡荆素峰（s）为参照峰（下同），计算得其他特征峰［异肥皂草苷峰（峰1）、异荭草苷峰（峰2）、木犀草素峰（峰4），下同］相对保留时间的RSD为0～0.15%，相对峰面积的RSD为0～1.04%，均小于3.0%（n=6），表明方法精密度良好。

稳定性试验：取同一颗粒供试品溶液适量，分别于室温下放置0，2，4，8，12，18，24，36，48，72 h时，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。其他特征峰相对保留时间的RSD为0.06%～0.22%，相对峰面积的RSD为0.35%～1.38%，均小于3.0%（n= 10），表明供试品溶液在室温下放置72 h内基本稳定。

重复性试验：取同一批颗粒样品（编号S3）适量，共6 份，按2.2 项下方法制备颗粒供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。其他特征峰相对保留时间的RSD为0.03%～0.11%，相对峰面积的RSD为0.10%～1.00%，均小于3.0%（n=6），表明方法重复性良好。

2.4.2 图谱建立及相似度评价

取10 批颗粒样品（W 公司）各适量，按2.2 项下方法制备颗粒供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，将10批颗粒样品色谱图结果依次导入中药色谱特征图谱相似度评价系统（2012版）进行分析，记录叠加特征图谱（图2）。采用中位数法，时间宽度设定为0.1 min，进行多点校正和自动匹配，生成特征图谱共有模式（图3），峰1 在336 nm 波长处明显，可清晰辨别，峰2，3，4 经对照品二次比对可确认。结果W 公司的10 批颗粒样品相似度为0.998～1.000，表明相似度良好，说明不同批次间颗粒样品差异较小，质量较稳定。

图2 10批颗粒样品超高效液相色谱叠加特征图谱Fig.2 HPLC superimposed characteristic chromatograms of 10 batches of granule samples

图3 颗粒样品超高效液相色谱对照特征图谱1.Isosaponin 2.Isoorientin 3.Isovitexin 4.LuteolinFig.3 UPLC reference characteristic chromatograms of the granule sample

10 批颗粒样品的各特征峰（峰1、峰2、峰4）与s 峰（相对保留时间规定值为1.00 min）的平均相对保留时间为0.59，0.84，1.65 min，相对保留时间的RSD为0～0.55%。

取颗粒样品（S1 - S10，S12 - S13）、药材饮片样品（S11），按2.2项下方法制备颗粒供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定。结果见图4，S1 - S10，S12 - S13的色谱图差异明显，W 公司颗粒样品色谱图与饮片（S11）相似度高。

图4 颗粒样品、饮片样品指纹图谱比对Fig.4 Comparison of characteristic chromatograms of granule samples and decoction piece samples

2.5 异牡荆素含量测定

2.5.1 方法学考察

专属性试验：取2.2 项下异牡荆素对照品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。详见图5。

图5 超高效液相色谱图1.Isovitexin A.Reference solution B.Negative reference solutionFig.5 UPLC chromatograms

线性关系考察：取2.2项下异牡荆素对照品溶液适量，倍比稀释，制成系列对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以异牡荆素质量浓度（X，µg/mL）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=28.79X+7.722（R2=0.999 6），结果表明，异牡荆素质量浓度在2.54～254.00µg/mL 范围内与峰面积积分值线性关系良好。

精密度试验：取高、中、低质量浓度的异牡荆素对照品溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样分析，每个质量浓度连续进样测定3 次，连续测定3 d。结果日内精密度的RSD为0.31%～1.00%（n= 3），日间精密度的RSD为0.94%～1.38%（n=3），RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批颗粒供试品溶液适量，按2.1项下色谱条件进样测定，分别于室温下放置0，2，4，8，12，24，36，48，72 h 时进样测定，记录峰面积。结果异牡荆素峰面积的RSD小于2%（n=9），表明供试品溶液室温下放置72 h内稳定性良好。

重复性试验：取颗粒样品（编号为S3），按2.2 项下方法制备颗粒供试品溶液，共6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算异牡荆素含量。结果异牡荆素含量的RSD小于2%（n= 6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取颗粒样品（编号为S3）0.25 g，精密称定，分别加入150%，100%，50%3 个质量浓度的异牡荆素对照品溶液，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果加样回收率为96.24%～104.22%，平均加样回收率为99.62%，RSD为0.11%～2.61%（n=9）。

2.5.2 含量测定

取各颗粒样品适量，按2.2项下方法制备颗粒供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，结果见表2（其中-为未测出）。W 公司10批颗粒样品中异牡荆素含量在5.40～5.54 mg/g，平均5.49 mg/g。故规定以异牡荆素含量的70%为下限设定含量限，即每1 g 菥蓂配方颗粒中异牡荆素含量不得少于3.85 mg。

表2 样品中异牡荆素含量测定结果（n=3）Tab.2 Results of the content determination of isovitexin in samples（n=3）

3 讨论

3.1 液相色谱条件

本研究中首先采用全波长扫描，通过色谱峰数目和响应值大小筛选检测波长。发现在336 nm 波长条件下，菥蓂配方颗粒的特征图谱基线较平稳，峰容量较大且具有较高响应值，故选择336 nm 为检测波长；以峰容量、各峰间的分离度、峰对称性为指标，考察流动相的组成（乙腈- 水、乙腈- 0.1%醋酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液），最终确定乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相，并对洗脱时间、比例进行优化；以特征峰保留时间、色谱峰分离度及对称性为指标，考察了柱温（25，30，35 ℃）、流速（0.75～0.85 mL/ min）对特征峰分离效果的影响，结果表明，流速对分离度及色谱峰峰形影响较大，当柱温为30 ℃、流速为0.80 mL/ min 时特征峰分离良好。

比较使用相同规格（100 mm×4.6 mm，2.7µm）不同厂家的色谱柱（Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB -C18柱，月旭Boltimate LP-C18柱，迪马Navigatorsil C18柱），结果表明，迪马和月旭色谱柱在同一色谱条件下，除色谱峰峰对称性稍劣于安捷伦色谱柱外，其他色谱行为均与后者相同。在不同的超高效液相仪器（Waters 和Agilent）上进行考察，该色谱条件在两个厂家的仪器上均能得到一致的色谱图，表明本研究所建立的色谱条件耐用性良好。

3.2 质谱解析

目前已有文献报道通过化学成分分离、质谱鉴定等方法对菥蓂所含化合物进行鉴定，结果表明其主要含有黄酮苷类［11］成分。本研究在已有研究的基础上，采用UPLC - MS/ MS 技术分析药材样品中的化学成分，共表征了14 个化合物，其中柠檬酸、丹参素、原儿茶酸及荭草苷4个化合物为首次从菥蓂药材中检出。

3.3 提取条件优化

在供试品溶液制备过程中，分别考察了提取方法（超声、加热回流、冷浸），5 种不同提取溶剂（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、70%乙醇、水），提取时间（15，30，45 min），液料比（1∶25，1∶50，1∶100）对颗粒样品有效成分提取率的影响。考虑到配方颗粒在实际应用中主要以热水冲服，本研究中对水和有机溶剂的提取结果进行了比较，发现二者在提取化合物的数量上无明显差异，但峰面积有差异，其中水提物的特征峰平均单位峰面积为3 352.766 ± 56.95，而70%甲醇提取物为4 073.72 ±65.87。因此综合峰容量、总峰面积/称样量、实验操作简便易行等因素，选择液料比1∶50，70%甲醇超声提取30 min作为颗粒样品供试品溶液的制备方法。

3.4 特征图谱研究

本研究中在生成对照图谱时采用中位数法，可避免用平均数法易受个别超常样本影响的缺点，使图谱更具代表性［13］。对来源于不同公司的颗粒样品图谱的相似度进行评估，来源于W 公司的10 批样品相似度为0.998～1.000，结果表明W 公司的配方颗粒生产工艺稳定，批次间差异较小；S12和S13样品的谱图相似度较高，但与W 公司差距较大，这可能与不同厂家所使用饮片来源不同或制剂工艺不同有关。有文献报道，菥蓂药材地上部分与来源于白花败酱的败酱草相似，导致二者常出现混用的情况［20-21］，因此不排除药材基源不同的可能。W 公司菥蓂配方颗粒的原料饮片经鉴定为十字花科植物菥蓂的干燥地上部分，且发现在同一试验条件下，菥蓂药材饮片液相色谱图与W 公司生产的配方颗粒色谱图相似性较高。由于配方颗粒丧失药材性状特征及显微特征鉴定，研究出准确且具有代表性的特征图谱对配方颗粒鉴定尤为重要，因此收集市面上常见厂家所生产的菥蓂配方颗粒相比较，结果发现不同厂家产品的色谱图差异较大。

综上所述，本研究首次通过高分辨质谱检出菥蓂药材中柠檬酸、丹参素、原儿茶酸及荭草苷4个化合物，同时建立了以异肥皂草苷、异荭草苷、异牡荆素、木犀草素4个黄酮类成分为特征峰的UPLC特征图谱和异牡荆素含量测定质量标准，为菥蓂配方颗粒质量控制提供了参考。