黄 江，黄 锐，袁 渊，蒲清荣，杨思进，白 雪，杨云芳

（西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000）

麝香化瘀醒脑方是我院国家临床重点专科中医脑病团队治疗出血性中风病的临床经验方。该方由麝香、黄芪、三七、生大黄、桂枝、大血藤、泽泻等药材制成，有风药开窍、活血利水功效，治疗出血性中风病急性期疗效较好，且安全可靠［1-5］。为方便患者服用与携带，我院拟将其研制成中药颗粒剂。为充分发挥方中药物活性成分功效，根据该制剂处方中各药材相关的化学成分与药理作用，对方中君药麝香、臣药三七（打粉）直接入药，其余药材以水为溶剂进行煎煮提取；以具有泻下利湿、逐瘀通经功效，且与该方功效基本一致的其余药材（除上述2 味药材）中总蒽醌含量和干浸膏质量作为综合评价指标［5-8］，采用L9（34）正交试验法优选该制剂的水提工艺参数，为其制备提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC - 20AT 型高效液相色谱仪、AUW120D 型电子天平（日本Shimadzu 公司）；QP - 01 型真空泵（天津奥特赛恩仪器有限公司）；JPGT0328型全数字超声波发生器（武汉嘉鹏电子有限公司）；NRB17S3W 型电冰箱（日本Panasonic公司）；HH 数显电热恒温水浴箱（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）；ZK072型电热真空干燥箱（上海实验仪器厂）。

1.2 试药

大黄素对照品、大黄酚对照品、大黄酸对照品、大黄素甲醚对照品、芦荟大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为110756 - 200110，110796 -201520，110757 - 201607，110758 - 201415，110795 -201710，含 量 分 别 为96%，99.4%，99.3%，99.2%，98.3%）；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。麝香、黄芪、三七、大黄、桂枝、大血藤、泽泻药材饮片（泸州宝光医药有限公司，批号分别为19052001，191202，191102，190701，200101，190402，191001）。

2 方法与结果

2.1 干浸膏质量测定

按麝香化瘀醒脑方处方比例称取黄芪、生大黄、桂枝、大血藤、泽泻等5 味中药材饮片9 份，提取，滤过、浓缩，加甲酸定容至500 mL（相当于原药材46 g）。精密量取提取液50 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴浓缩至膏状，105 ℃干燥至恒重，置干燥器中30 min，迅速精密称定质量，计算干浸膏质量（g）［9］。

2.2 总蒽醌含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：UltimateTMC18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇- 0.1%磷酸水溶液（85∶15，V/V）；流速：1 mL/ min；检测波长：254 nm；柱温：40 ℃；进样量：10µL。

2.2.2 溶液制备

对照品溶液：称取大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素对照品各适量，精密称定，加甲醇分别制成每1mL 含大黄素、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素各80µg，大黄素甲醚40µg 的单一对照品溶液，各精密量取2 mL，混匀，即得混合对照品溶液。

供试品溶液：取2.1 项下提取液适量，以甲醇定容至500 mL，滤过。精密吸取续滤液5 mL置烧瓶中，水浴挥干，加8%盐酸溶液10 mL，超声（功率350 W，频率35 kHz；下同）处理2 min，加三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：称取处方量麝香化瘀醒脑颗粒阴性样品（不含大黄），按供试品溶液制备方法制备，即得。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10µL，按2.2.1 项下色谱条件进样测定。结果供试品溶液在与对照品溶液相同保留时间处有相应色谱峰，且阴性对照无干扰，理论板数按大黄素峰计应不低于3 000［10］，专属性良好，见图1。

图1 高效液相色谱图1.Aloe emodin 2.Rhein 3.Emodin 4.Chrysophanol 5.Emodin methyl ether A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取2.2.2项下混合对照品溶液1，4，8，12，16，32µL，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以进样量（X，µg）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的回归方程分别为Y1=4 991.2X1- 35.6（R2= 0.999 8）、Y2= 3 476.4X2-37.3（R2= 0.999 7）、Y3= 5 610.2X3- 22.4（R2=0.999 9）、Y4= 4 079.3X4- 33.7（R2= 0.999 9）、Y5=869.4X5-69.5（R2=0.999 8）。结果表明，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚进样量均在0.016 ～0.512µg范围内，大黄素甲醚在0.008 ～0.256 µg 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液适量，按2.2.1项下色谱条件连续进样测定5次，记录峰面积。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为1.15%，1.25%，1.33%，1.27%，0.66%（n=5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于室温下放置0，2，4，6，8，12 h时按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为1.01%，0.59%，1.09%，1.46%，1.29%（n=6），表明供试品溶液室温下放置12 h内基本稳定。

重复性试验：取同一提取液6 份，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为1.35%，1.51%，1.53%，1.36%，1.25%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：称取已知含量的样品9 份，每份约5 g，精密称定，分别按其中所含芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的50%，100%，150%，加入各单一对照品溶液，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

耐用性试验：取同一供试品溶液适量，分别在色谱条件一定波动范围［流速（0.8± 0.2）mL/min，检测波长（254±2）nm，柱温（40±5）℃］内进样测定，记录峰面积并计算含量。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的RSD分别为0.73%，0.65%，1.01%，1.12%，1.05%，表明该色谱条件小范围变化时本方法能满足试验要求，耐用性良好。

2.3 正交试验优选水提工艺

根据处方中各药物性质，麝香、三七（打粉）直接入药，其余药物采用传统的水煎煮法提取。以加水量（因素A）、浸泡时间（因素B）、提取时间（因素C）、提取次数（因素D）为考察因素，以干浸膏质量与总蒽醌含量的综合评分为评价指标，优选最佳水提工艺参数。综合评分=［（干浸膏质量/干浸膏质量最大值）× 0.5 +（总蒽醌含量/总蒽醌含量最大值）×0.5］×100［11-12］。因素与水平见表2，正交试验设计与结果见表3，方差分析结果见表4。

表2 因素与水平Tab.2 Factors and their levels

由表3可知，各因素对水提工艺综合评分的影响顺序为D ＞A ＞C ＞B，最佳工艺组合为A3B1C3D2。由表4可知，各因素对结果均有显著影响。综合考虑提高生产效率与节约能耗等因素，最终优化提取工艺为A2B1C1D2，即加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮2次，每次1.0 h。

表3 L9（34）正交试验设计与结果Tab.3 Deign and results of the L9（34）orthogonal test

表4 方差分析结果Tab.4 Results of the ANOVA

2.4 验证试验

按选定的最佳工艺进行3 次提取试验，结果稳定。详见表5。

表5 验证试验结果Tab.5 Results of the validation test

3 讨论

本研究中根据麝香化瘀醒脑方中各药材药理活性特点等信息，同时考虑我院制剂生产特点，将方中麝香、三七（打粉）直接入药，黄芪、大黄等5味药材进行水提。以提取液作为黏合剂，以糊精为辅料，加入三七粉、麝香，采用湿法制粒法制粒，干燥、整粒即得麝香化瘀醒脑颗粒［11-12］。提取工艺为药物制剂的关键因素，因此本研究中采用正交试验研究麝香化瘀醒脑颗粒的提取工艺，综合比较各因素对提取效果的影响程度，并研究各因素的主次及相互作用，从而确定最优提取工艺条件［13］。

麝香化瘀醒脑颗粒中，大黄具有泻下利湿、逐瘀通经功效，与麝香化瘀醒脑颗粒组方原理基本一致，故笔者根据预试验结果，选择大黄有效成分总蒽醌含量及干浸膏质量各占50%权重的综合评价指标［14-15］控制质量，采用正交试验设计优选麝香化瘀醒脑颗粒水提工艺参数，并经验证其参数稳定、可靠。测定大黄总蒽醌含量的高效液相色谱（HPLC）法及色谱条件参考了2020 年版《中国药典（一部）》中大黄药材项下相关内容，结果分离效果好且峰形不拖尾，能较好地将5 种蒽醌类物质分离。综上所述，本研究中优化的工艺操作简便，结果稳定，可用于麝香化瘀醒脑颗粒的水提。建立的HPLC法快速，灵敏度、准确度高，可为麝香化瘀醒脑颗粒生产过程中的质量控制及其后续质量标准研究提供参考。