刘静莎，张健鹏

（1.北京市顺义区医院重症医学科，北京 101300；2.中国人民解放军总医院第三医学中心呼吸科，北京 100039）

人体呼出气主要由氮气、氧气、二氧化碳、水和其他气体组成；同时在呼出气中存在一些浓度范围在ppbv ～pptv 的挥发性有机物（痕迹气体）[1]。挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）主要指的是在常温的状态下饱和蒸汽压力超过133.32 Pa，且在常温状态下沸点处于50 ～260℃之间的有机化合物[2]。人体内的VOCs 是在人体组织的正常生理过程和与疾病相关的病理过程中产生的[3]。所有的细胞都会在一定程度上产生一些VOCs，其相对丰度和反应会导致呼出气中的VOCs 谱发生特定条件下的变化[4]。人体新陈代谢的部分产物可经血液运送至肺部，通过气体交换进入肺泡而出现在呼出气中。当人体处于炎性反应、氧化应激等状态时，体内代谢发生改变，其中一些挥发性物质会进入血液循环，并在血液流经肺泡进行气体交换时通过呼出气排出体外[5]。呼出气体中VOCs 成分和量的不同，可反映人体不同的病理生理状态。因呼出气可挥发性有机物成分检测具有无创、操作便捷、高灵敏度及高特异性等特点，近年来其被认为可能成为一种安全便捷的疾病早期诊断方法[6]。但目前的相关研究多采用气相色谱、质谱等技术，这些检测技术均存在着操作方法极其复杂、重复性差、检测标准和方法不统一、对操作人员要求高等缺点，与相关实际临床应用尚存在较大的距离。光声光谱气体检测技术是利用光声效应实现痕量气体检测的一项重要技术, 具有高灵敏度、高选择性、零背景信号、可实时在线监测等优点, 在环境监测、采矿冶金、能源电力、医疗卫生等领域发挥着至关重要的作用[7]。本研究拟采用光声光谱技术（Photoacoustic spectroscopy, PAS）进行相关检测，同时观察比较了细菌性肺炎患者的呼出气与健康对照组的呼出气中VOCs 光声光谱检测之间的差异，以期对细菌性肺炎的病原菌进行早期识别。

1 资料与方法

1.1 临床资料

随机选择在某三甲医院住院的痰细菌培养阳性的肺炎患者12 例（其中大肠杆菌肺炎4 例，肺炎克雷伯杆菌肺炎8 例）、医院健康工作人员6 例作为观察对象。肺炎患者作为肺炎组、健康工作人员作为健康对照组。肺炎组：（1）纳入标准：①年龄18 ～80岁，性别不限；②确诊细菌性肺炎；③连续三次痰细菌培养出同一种且单一的致病菌；④无吸烟史，无循环系统疾病、消化系统疾病、糖尿病、肾功能不全等基础疾病；⑤知情同意参与研究。（2）排除标准：①合并其他系统疾病；②需要进行有创或无创通气的患者；③通气或换气功能障碍者；④无法配合正确收集呼出气体的患者。健康对照组：（1）纳入标准：①年龄18 ～80 岁，性别不限；②无吸烟史，无呼吸、循环、消化、泌尿及血液系统疾病；③近两周内未发生急性呼吸系统感染；④知情同意参与研究。（2）排除标准：①近两周内发生过急性呼吸系统感染者；②存在其他系统疾病者。

1.2 实验器材

1.2.1 Tedlar 气体采样袋及外接一次性吹嘴 Tedlar 气体采样袋及外接一次性吹嘴由大连德霖气体包装有限公司提供( 见图1.1)。Tedlar 气体采样袋容量为300 mL。反复利用时需用纯氧气进行反复充气和抽气，并在60℃条件下老化4 h（经过老化后的采样袋能有效降低背景值，可以再次使用）。

图1.1 Tedlar 气体采样袋

1.2.2 光声光谱分析仪（PASTA-1001）PASTA-1001光声光谱分析仪由中国航天科技集团北京某研究所研发( 见图1.2)。主要参数：气体采样容积为30 mL；检测时间30 min；检测精度PPb 级；在0 ～40℃的工作条件下，其测量结果不会因环境温度和气压的变化而产生漂移。

图1.2 PASTA-1001 光声光谱分析仪

1.3 实验方法

1.3.1 受试者呼出气的采集（1）第一次使用Tedlar采样袋时，将其用蒸馏水清洗干净，烘干，去除残留物。之后重复使用时用纯氧气进行反复充气和抽气3次，以置换残留气体备用。（2）受试者晨起后保持空腹安静状态，在通风良好的室内平静呼吸0.5 h，用清水进行口腔清洁后待测。（3）连接一次性吹嘴，打开夹子，嘱患者向Tedlar 采样袋中吹气，反复呼吸数次，尽量使袋内气体接近肺泡气体浓度。（4）关闭夹子，于10 min 内连接光声光谱仪进行检测。

1.3.2 气样的光声光谱测量（1）将PASTA-1001 光声光谱检测仪开机预热至池温达到45℃（此状态下机器性能较稳定）。（2）将Tedlar 采样袋的出口端（夹闭状态）用橡胶管连接到PASTA-1001 进气阀管上，然后运行机器抽气1 min 形成管道负压（池压为233 mBar）。（3）打开橡胶管抽气，使仪器显示压力平衡后运行机器检测，分别获得初始实验数据和初始光谱曲线（X 值表示波数 cm-1，Y 值表示幅值au）。本试验选择检测波数范围为1000 ～1250 cm-1，因为此波数段可涵盖绝大部分的VOCs 和部分无机挥发性化合物，其中幅值与所测挥发性化合物的浓度成正比。（4）重复采用上述方法检测其他标本。

1.4 数据分析

将各组光声光谱图分析结果采用Originpro 8.5 绘图软件处理后得到光声光谱图（X 值表示波数 cm-1，Y 值表示幅值au）。本试验选择检测波数范围为1000 ～1250 cm-1，因为此波数段可涵盖绝大部分的VOCs 和部分无机挥发性化合物，其中幅值与所测挥发性化合物的浓度成正比。

2 结果

2.1 细菌性肺炎患者呼出气与健康对照组呼出气的光声光谱检测

为寻找大肠杆菌肺炎患者的特异性波峰，将大肠杆菌肺炎患者呼出气与健康对照组呼出气的光声光谱测量结果进行逐一对比（见图2.1）。得出大肠杆菌肺炎患者在1120 ～1126 波数段、1228 ～1232 波数段及1236 ～1238 波数段处出现区别于健康对照组的波峰（图2.1 A1、A2 为局部放大图），而在其他波数段则未见明显区别。

图2.1 大肠杆菌肺炎患者与健康对照组呼出气的光声光谱检测（图2.1 A1、A2 为局部放大图）

进一步将4 例大肠杆菌肺炎患者和6 例健康对照组人员进行一一对比（见图2.2），我们发现4 例大肠杆菌肺炎患者的特征峰如下：（1）1236 ～1238 波数段：4 例大肠杆菌肺炎患者均有出现，出现频率均为100%（见图2.2 a2）；（2）1228 ～1232 波数段：4 例大肠杆菌肺炎患者均有出现，出现频率均为100%（见图2.2 a2）；（3）1120 ～1126 波数段：有2 例表现为上述的单峰，另外2 例表现为双峰，该波数段的波峰在大肠杆菌肺炎患者中的出现频率为50%（见图2.2 a1）。

图2.2 4 例大肠杆菌肺炎患者的光声光谱检测结果

在1120 ～1126 波数段，6 例健康对照组人员均出现与大肠杆菌肺炎患者不同的双峰（见图2.3 D1）。因此，大肠杆菌肺炎患者在1120 ～1126 波数段出现的单峰可初步将其与健康对照组相鉴别。而在1224 ～1228 波数段及1236 ～1238 波数段，6 例健康对照组人员中有4 例出现了与大肠杆菌肺炎相同的波峰（见图2.3 D2）。可见，这两个波峰对于区分大肠杆菌肺炎患者及健康对照组无特异性。因此，大肠杆菌肺炎患者在1120 ～1126 波数段出现的单峰，可作为大肠杆菌肺炎的特异性波峰（我们命名为E 峰），用于早期鉴别大肠杆菌肺炎。

图2.3 健康对照组在与大肠杆菌肺炎相应部位出现波峰情况的放大图

2.2 肺炎克雷伯杆菌肺炎患者与健康对照组呼出气光声光谱检测结果的比较

与上组比较相同，对肺炎克雷伯杆菌肺炎患者呼出气与健康对照组呼出气的光声光谱测定结果进行对比。从图2.4 可以看出：肺炎克雷伯杆菌肺炎患者在1236 ～1238 波数段及1240 ～1242 波数段处出现区别于健康对照组的波峰（图2.4 B6 为局部放大图），在其他波数段未见明显区别。

图2.4 肺炎克雷伯杆菌肺炎患者与健康对照组呼出气的光声光谱检测结果

将6 例肺炎克雷伯杆菌肺炎患者逐一与健康对照组对比发现，6 例肺炎克雷伯杆菌肺炎患者在不同波数段出现区别于健康对照组波峰的情况如下：（1）1236 ～1238 波数段：有3 例出现区别于健康对照组的波峰（见图2.5 b1）；（2）1240 ～1242 波数段：有3 例出现区别于健康对照组的波峰（见图2.5 b1）。

6 例健康对照组人员在不同波数段出现与肺炎克雷伯杆菌肺炎相似波峰的情况如下：（1）1236 ～1238 波数段：有5 例出现与肺炎克雷伯杆菌肺炎相似的波峰；（2）1240 ～1242 波数段：均未出现与肺炎克雷伯杆菌肺炎相似的波峰（见图2.5 D3）。因此，通过光声光谱检测结果中1240 ～1242 波数段波峰的存在与否可将肺炎克雷伯杆菌肺炎患者与健康对照组相区别。1240 ～1242 波数段波峰可作为肺炎克雷伯杆菌肺炎的特异性波峰（我们命名为K 峰）。

图2.5 6 例肺炎克雷伯杆菌肺炎患者及6 例健康对照组人员在相应波数段出现波峰的情况

综上所述，大肠杆菌肺炎患者及肺炎克雷伯杆菌肺炎患者可分别依据1120 ～1126 波数段（灵敏度为50%，特异度为100%）及1240 ～1242 波数段（灵敏度为50%，特异度为100%）与健康对照组初步相鉴别。

3 讨论

PAS 是分子光谱学的一个重要分支，是基于光声效应的一种微量气体检测方法。用一定频率调制的光源照射物质分子吸收一定的光能后，在由受激态通过非辐射过程跃迁到低能态时，会产生同频的声波（光声信号），这一现象称为光声效应[8]。PAS 主要是根据目标气体的光声信号随着入射光的波长变化形成谱线，从而做到对目标气体的即时识别。与传统检测技术相比，其具有高灵敏度、高选择性、高稳定性、样品无需进行预处理、不消耗气样、可动态监测、光谱范围较广及检测快速等诸多优点。因此其受到了国内外学者的广泛关注。

与传统光谱分析方法不同, PAS 主要是监测物体吸收光能后产生的热能中以声压形式表现出来的能量部分，即使在高反射弱吸收的情况下，吸收能也可被微音器检测到[9]。红外光谱由原子振动和分子转动产生, 故又称为分子的振- 转光谱。红外光谱有三个分区：（1）近红外区，指波长为780 nm ～2.5 μm 的波数段；（2）中红外区，指波长为2.5 μm ～25 μm的波数段；（3）远红外区，指波长为25 μm ～1000 μm的波数段[10]。气体分子在红外光谱区的吸收是由于分子振动或转动的状态变化或者分子振动或转动状态在不同能级间的跃迁而产生的[11]。

细菌的代谢较之人体代谢来说，具有代谢更加旺盛、代谢类型更加多样的特点。不同的细菌含有的酶不完全相同，对营养物质的分解能力亦不一致，因而其代谢产物有区别，所产生的VOCs 种类有差异。根据此特点，可利用生物化学方法来鉴别不同细菌[12]。严冰[13]通过用细菌感染体外肺组织建立模型，检测其产生的VOCs 发现，大肠杆菌感染组存在十二烷、间-(1,1- 二甲基- 乙基)- 苯、十六醇三种特征性气体成分，铜绿假单胞菌感染组则存在十二烷、间-(1,1-二甲基- 乙基)- 苯、2,4,6- 三(1,1- 二甲基- 乙基)-苯酸三种特征性成分。细菌感染人体后会产生相应的代谢产物，进而会出现在人的呼出气中，而不同的气体分子在用光声光谱技术进行检测时会在不同的波段产生不同形态及幅度的波峰。

本研究应用光声光谱技术检测细菌性肺炎患者及健康人的呼出气并分析对比两组的指纹图谱发现：大肠杆菌肺炎患者呼出气在1120 ～1126 波数段出现区别于健康对照组的特异性波峰（灵敏度为50%，特异度为100%），暂将其命名为E 峰（E 为Esherichia Coli 首字母）；肺炎克雷伯杆菌肺炎患者呼出气在1240 ～1242 波数段出现区别于健康对照组的特异性波峰（灵敏度为50%，特异度为100%），暂称其为K 峰（K 为Kleosiella Pneumoniaez 首字母）；但是这些特异性波峰所代表气态物质的具体成分目前并不清楚，尚需进一步研究阐明。

人体新陈代谢的部分产物会随血液流经肺部，并通过气体交换进入肺泡，然后随呼出气呼出。当人体受到外界病原体入侵或本身代谢状态改变，如发生炎性反应、氧化应激等状态时，体内代谢发生改变，随之呼出气中的代谢产物也会有所不同，在光声光谱检测时便体现为波峰形态及位置的不同；依靠这些不同的波峰我们可以将肺炎患者及健康对照组初步区分。

综上所述，将光声光谱技术应用于细菌性肺炎病原菌的识别检测，是对细菌性肺炎诊断的一次新的尝试。目前可供参考的相关文献及方法有限，本研究还存在一定的不完善和不足之处，比如因入选标准比较严格，本研究样本量较小，结果的代表性不足；加之细菌产生的VOCs 在人体呼出气中含量甚微，同时人体在细菌入侵引起的感染状态时发生氧化应激所产生的VOCs 对细菌代谢物检测也存在一定干扰。因此，在后续的研究中仍需扩大样本量、改进研究方法，进而让光声光谱这一灵敏、即时、高效的检测技术能够尽早广泛地应用于相关临床早期诊断。