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搜风祛痰中药对动脉粥样硬化ApoE基因敲除小鼠IL-1β及IL-18的影响*

2023-03-27宫丽鸿李思琦肖福龙

光明中医 2023年5期
关键词:阿托斑块中药

张 磊 宫丽鸿 赵 兵 李思琦 肖福龙

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)指由于脂质代谢障碍,在动脉及其分支血管壁内膜发生脂质沉积,最后成为粥样病灶的慢性炎症性疾病[1]。近年来,大批研究证明,AS并不是简单的脂质被动浸润,而是一个主动的有免疫学程序参与其中的炎症性过程[2]。由于动脉血管内皮损伤,脂质大量沉积,活化内皮细胞,从而诱发炎症反应,释放炎症因子,进而导致斑块形成[3]。随着时间的推移,斑块中的各种免疫细胞会进一步引起局部的炎症反应及斑块的形成,而炎症反应的逐步加重不利于斑块稳定,这也会导致斑块破裂以及血栓的成型,最后会造成心血管病变的出现[4,5]。整体而言,炎症反应对AS的发病会产生极大的影响,并贯穿AS的整个过程。在AS斑块产生、进展与破裂场景中存在炎性因子的介导。而IL-1β与IL-18是参与炎症反应的重要炎症因子[6,7]。所以,AS早期依靠抑制IL-1β与IL-18的释放机制,能够较为高效地干预AS的进展,进一步降低斑块问题的出现。动物实验已得出中药的治疗方法对于抗AS与稳定斑块等取得了较为理想的效果[8,9],所以本研究将基于现有的研究成果,综合观察所选中药对小鼠IL-1β及IL-18表达水平所产生的影响,进一步探讨其治疗AS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择60只6周雄ApoE小鼠,采购自北京华阜康,其具体的批号是:SCXK (京) 2020-0004。同时选定总数量为20只C57BL/6J小鼠,采购自辽宁长生,其具体的批号数据则是:SCXK (辽) 2020-0001。本次研究工作经过了院内伦理委员会的审核,具体的编号为:21000042020038。

1.2 实验药品搜风祛痰中药:全蝎5 g,蜈蚣1条,地龙15 g,陈皮15 g,法半夏15 g,白术15 g,水蛭15 g,加工成含生药2 g/ml浓缩液待用,购于辽宁中医中草药局;阿托伐他汀钙片:10 mg/片(该产品采购于辉瑞,其具体的批号数据是:EG6187)。

1.3 实验试剂及仪器苏木素伊红(该产品采购于索莱宝科,其具体的批号数据是:G1120);辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG;离心机,FC酶标仪;脱水、包埋、切片机;CHA型光学显微镜。

1.4 构建 AS 模型对于实际数量为60只的ApoE小鼠,进行持续1周的普食,后续则是调整成高脂饲料,采购于盛旺牧业。高脂喂养13周之后,运用随机法选定4只进行处死处理,取腹主动脉血管,后续依靠HE染色程序,确认造模程序是否顺利完成[10]。

1.5 分组与处理随机选定50只顺利完成造模的ApoE小鼠,随机分为模型组,中药低、中、高剂量组和西药组,每组实际数量为10只,提供相应的高脂饲喂。空白对照组选定10只C57BL/6J小鼠,提供一般饲料开展喂养。并依据临床上成人每日口服药物用量,以及小鼠与人的口服药物等效用量换算公式[11],计算得出各组小鼠每日所需的灌胃量。各组小鼠共进行为期13周的灌胃,每日1次。对于对照与模型组,采用0.3 ml/d生理盐水开展相应灌胃处理;对于西药组则是采用具体剂量为25.4 mg/(kg·d)的阿托伐他汀钙片,予以灌胃处理;对于中药低、中、高剂量组则分别采用具体剂量为 6.175 g/(kg·d)、12.35 g/(kg·d)、24.7 g/(kg·d)的搜风祛痰中药进行灌胃给药。实验完成时,从各组小鼠眼球处取出血液样本置于抗凝管中,而且基于4 ℃环境之中,将有着血液样本的相关抗凝管放入到离心设备内,设定具体参数为3000 r/min处理15 min,最后分离所需血清并做除菌处理,存放于EP管中一并存放于-80 ℃冰箱中备用。后续对于小鼠开展脱颈处死,处死后立即解剖小鼠并提取小鼠的心脏和腹主动脉,并用10%甲醛溶液将其固定。

1.6 观察指标及方法

1.6.1 HE染色观察斑块面积处死小鼠提取腹主动脉,应用4%多聚甲醛,将腹主动脉持续处理24 h,石蜡包埋。样本应用切片机进行处理,处理为5 μm切片,后续应用苏木精与伊红进行染色处理之后,放入到显微镜中开展观察工作。

1.6.2 Western Blot检测细胞IL-1β和IL-18蛋白表达水平实验完成时收集所需组织细胞,按照细胞样本量以1∶10的比例加入细胞裂解液裂解样本细胞,然后加入蛋白提取剂以提取样本蛋白,样本匀浆后于冰上静置20 min,离心后将上清液置于EP管中待用。运用Brad-ford法测试具体的蛋白浓度数据,将各组蛋白浓度数据调控一致。对于各个孔上样同等剂量的样品,后续应用SDS-聚丙稀酰胺凝胶开展针对性的电泳处理,电泳完成后获得的蛋白转移到PVDF膜,增添一抗之后放入到4 ℃环境过夜,再加入二抗置于室温下孵育1 h,ECL显影之后,使用感光胶片进行曝光处理,依靠图像系统开展扫描操作,测定获得目的与内参蛋白之间的具体灰度参数,而且计算两者之间的比值,以此值作为所测样本蛋白的表达量。

2 结果

2.1 各组小鼠HE染色比较对照组:未见斑块,内膜保持光滑与完整状态。模型组:管壁破损,存在大量泡沫的细胞,内膜有一定的增长,形成斑块。中药低、中、高剂量组和西药组:内膜都会有一定的斑块,但是均显著少于模型组,且中药中剂量组面积最小。见图1。

图1 各组斑块面积(HE染色,×100 倍)

2.2 各组细胞IL-1β和IL-18蛋白表达比较与对照组数据进行对比,模型组IL-18、IL-1β指标升高(P<0.05)。见表1。与模型组数据进行对比,中药各剂量组和他汀组IL-18、IL-1β指标均降低(P<0.05)。各组细胞IL-1β和IL-18蛋白电泳图见图2。

表1 各组小鼠IL-18 IL-1β蛋白表达水平比较 (例,

注:1:对照;2:模型;3:中药低剂量;4:中剂量;5:高剂量;6:西药。图2 各组细胞IL-1β和IL-18蛋白电泳图

3 讨论

AS是冠心病的主要发病因素,对人民身体健康和生活质量都带来了很大的负面影响[12]。虽然中医学中并没有AS这个病名,但通过对AS临床表现的观察和总结可将其归属于中医“胸痹”范畴中。AS患者多为老年患者,平素喜食膏粱厚味,日久脾胃虚弱,运化失常,津液失于疏布而生痰浊,痰浊为无形实邪,容易导致人体气机的阻滞,造成气血运行受阻,体内出现瘀血,导致痹阻心脉问题的出现。痰浊和瘀血之间又可相互作用,痰瘀互结可痹阻阳气化生毒热,热极生风,风痰内动,这些机制会导致AS等病变,故宫丽鸿教授根据经验总结创新,创新性提出“风痰”是AS的主要致病因素[13,14],并创新性化裁《医学衷中参西录》中逐风汤,创搜风祛痰中药治疗以AS为基础的心血管疾病,取得显著疗效。方中蜈蚣、全蝎、地龙三药共用,兼具搜风止痉、通络止痛的治疗效果,共为君药;陈皮、法半夏、白术,兼具化湿健脾,理气化痰的治疗效果,在整个方剂之中作为臣药;水蛭有着破瘀通经的治疗效果,在方剂之中作为佐药,整方可以实现搜风祛痰、通络止痛之效。

炎症反应对于AS会产生显著的影响,血脂异常是其基础,二者相辅相成,共同构成了AS的基本发病机制。同时近期研究表明,胆固醇对于炎症反应会产生显著的影响,遭遇细胞吞噬之后能够激活NLRP3小体,从而促进IL-1β、IL-18的成熟及分泌[15-17],且IL-1β又可引起其下游的IL-18的激活,再度促进炎症反应的发生[18]。IL-1β、IL-18均是参与AS早期发病的重要炎症因子,且其表达水平与斑块及疾病严重程度成正比,故抑制IL-1β、IL-18的表达可以抑制AS的形成和发展,减少心血管事件的发生。

阿托伐他汀属他汀类药品,其对降脂、稳定斑块的效果已被普遍认可,同时阿托伐他汀具备抗炎症功能[19],可抑制IL-1β及IL-18等炎症因子的表达,而且具备改善内皮功能与抑血栓等积极效应[20]。因该药能够抑制炎症因子的表达,对于心血管病症有很大的价值,因此本次实验中最终决定采用阿托伐他汀充当对照组。

本研究结果表明,小鼠腹主动脉切片经HE染色观察对比,对照组未出现明显的斑块,模型组的斑块相对偏多,中药各组、西药组斑块都较模型组显著降低;通过斑块面积检测,意味着中西药疗法对AS都可以实现较为理想的疗效。和空白对照组数据相比,各组IL-1β、IL-18指标均升高,意味着正常情况下,两大因子为正常状态,所以对照组的2项指标都相对偏低。但血管内皮出现损伤问题后,大量脂质堆积,IL-1β、IL-18被激活释放,故模型组2指标均增高。搜风祛痰中药以及阿托伐他汀均有助于减少IL-1β、IL-18的生成,故二者表达水平降低。

综合前文分析可得出,搜风祛痰的治疗方案,能够较为高效地抑制炎症反应,使得IL-1β、IL-18的指标下调,缩小斑块面积,这或许是其对动脉粥样硬化的治疗机制之一。

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