刘为伦，赵景壮，卢彤岩，邵轶智，任广明，徐黎明

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连 116023）

传染性胰脏坏死病（infectious pancreatic necrosis，IPN）是一种高度传染性疾病，主要危害鲑鳟幼鱼。加拿大和美国是最早报导该疾病的国家，后来该疾病在欧洲和亚洲的十多个国家相继暴发[1]。20世纪80 年代末IPN 又传到日本，随后中国和韩国报导了该疾病[1]。该疾病在我国的辽宁、山西、山东、甘肃等地迅速扩散，给我国鲑鳟鱼养殖产业造成了巨大的经济损失。该病由传染性胰脏坏死病毒（infectious pancreatic necrosis virus，IPNV）引起。该病毒颗粒是一个无囊膜的正二十面体结构，直径约60 nm[2]。该病毒为双链RNA 病毒，拥有A、B 两段双链RNA 基因组，A 段基因含有两个开放阅读框（ORFs），分别编码约106 kDa 的pVP2-VP4-VP3 多聚蛋白前体和约15 kDa 的非结构蛋白VP5；B 段基因编码约94 kDa 的聚合酶蛋白VP1[3]。VP2 蛋白是IPNV 的主要抗原蛋白，其基因组包含了病毒的大部分抗原表位，是研究最多的蛋白，广泛用于IPNV的检测、血清型分类、基因分型以及疫苗的研发[4]。

我国主要通过药物治疗来防控该疾病[5]，而接种疫苗是预防病毒性疾病最有效的方法。目前已经商业化的IPN 疫苗为挪威Pharmaq 公司生产的IPN灭活疫苗（https://pharmaq.com/），国内尚无商业化的IPN 疫苗。本文综述了国内外IPN 疫苗的研究进展。已经报导的IPN 疫苗可分为灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗（DNA 疫苗、重组亚单位疫苗、活载体疫苗），可通过浸泡、口服和注射等方式接种，其中注射是最有效的接种方式[6]。

1 灭活疫苗

灭活疫苗是通过加热、紫外线照射等物理方法或通过灭活剂处理等化学方法使病毒失去活性制备而成[7]。目前，IPN 灭活疫苗的制备主要是通过灭活剂使IPNV 完全丧失活性。灭活剂具有特异性，不同类型的病原体的灭活效果有差别。不同病原使用的灭活剂及灭活条件不同，因此，确定病毒的最佳灭活剂和灭活条件（包括温度和时间）对制备高效的疫苗非常重要。已有的报导中，IPN 灭活疫苗的研制通常使用甲醛（formaldehyde）和β-丙内酯（beta-propiolactone，BPL）两种灭活剂灭活IPNV。

Hill 等[8]用1∶200 的甲醛溶液4 ℃灭活IPNV 24 h，用1∶250 的BPL 溶液37 ℃灭活IPNV 3 h，将灭活液腹腔注射虹鳟（Oncorhynchus mykiss），产生了较好的免疫保护效果。Dixon 和Hill[9]确定：在20 ℃用1∶200 的甲醛溶液灭活4 d 可完全灭活IPNV；在4 ℃下用1∶200 的BPL 溶液灭活6 d 可完全灭活IPNV。但是，在4 ℃下，用BPL 灭活的病毒抗原损失超过50%，而在20 ℃下用甲醛灭活的抗原损失只有10%～15%，用甲醛灭活的病毒腹腔注射免疫虹鳟后，空斑中和实验表明该疫苗对虹鳟有保护作用。该研究认为甲醛是灭活IPNV 的首选方法。Bootland 等[10]用1∶200 的甲醛溶液灭活IPNV，并用三种不同浓度的疫苗（3.6×107pfu·mL-1、3.6×108pfu·mL-1和3.6×109pfu·mL-1）浸泡接种8.5 周龄溪鳟（Salvellnus fontinalls），但死亡率却比未接种疫苗的死亡率高，说明浸泡免疫并没有保护效果。因此，灭活疫苗一般采用注射的方式免疫，与佐剂混合使用后效果会更好。2012 年Munang’andu 等[11]比较了油佐剂-灭活疫苗、聚乳酸-羟基乙酸（polylactic acidglycolic acid，PLGA）-灭活疫苗、DNA 疫苗以及大肠杆菌（Escherichia coli）-重组亚单位疫苗的保护效果，其中油佐剂-灭活疫苗的保护效果最好，相对保护率可达53.3%。为了确定最佳接种剂量，Munang’andu 等[12]将两种抗原剂量（2×1010TCID50、2×109TCID50·mL-1）的灭活疫苗均以0.1 mL 腹腔注射接种大西洋鲑（Salmo salar）。结果显示，当抗原剂量为2×1010TCID50·mL-1时，灭活疫苗免疫效果更佳。Tamer 等[13]用1∶200 甲醛室温灭活96 h，与763A 油佐剂1∶1 混合后将抗原剂量调整为2×1010TCID50·mL-1，灭活疫苗对虹鳟的相对保护率为79%。

2 减毒疫苗

减毒疫苗是指毒力降低的活病毒。该类病毒仍具有良好的抗原性和体内复制能力，在进入宿主后能够诱导宿主发生免疫反应产生特异性抗体，以预防强毒株的感染[14]。减毒疫苗的IPNV 毒性弱，不会引发疾病，但是仍具有活性，进入宿主体内可自主复制，诱导机体长时间的免疫反应。前病毒（provirus）是IPNV 毒性最弱的状态，是IPNV 在宿主细胞复制过程中产生的一个低密度的颗粒，里面包裹着病毒基因组RNA。这是IPNV 未成熟的状态，该颗粒可以通过碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）抑制多蛋白成熟获得[15]。Rivas-Aravena 等[15]用前病毒免疫虹鳟，产生了与IPNV 感染相似的细胞免疫反应和体液免疫反应，前病毒组中和抗体水平更高，病毒载量降低显著。这表明用前病毒制作减毒疫苗是一个很好的策略。

有研究发现，IPNV 毒株在大西洋鲑中的毒力决定基因位于VP2 氨基酸序列上第217、221 和247 位上的氨基酸残基，当221 位上的氨基酸是苏氨酸时，病毒不具有毒性[16,17]。可以根据这一特点，改造IPNV VP2 上的毒力基因来减弱病毒的毒性，以制备减毒疫苗。Munang’andu 等[17]将IPNV VP2上的第217 位氨基酸突变为脯氨酸（P）、221 位氨基酸突变为苏氨酸（T）、247 位氨基酸突变为丙氨酸（A）获得无毒的毒株，可以诱导大西洋鲑产生较高的抗体水平。

减毒疫苗在接种后会残留一些毒力，这些毒力虽然不致病，但是在进入鱼体后可能会存在毒力返强的风险，一定程度上导致其应用受限[18]。

3 基因工程疫苗

随着基因工程技术的快速发展，可以人工构建含有抗原基因的重组体，利用构建的重组体自身或者其表达产物制备出成本低、无致病性、安全性高的新型疫苗[19]。基因工程疫苗可将多个病原的抗原基因连接在一起，制备可同时预防多种疾病的多价疫苗，这比传统的灭活疫苗和减毒疫苗更有优势[20]。研发基因工程疫苗首先要确定IPNV 的抗原表位。Frost 等[21]对IPNV 抗原表位的定位发现，IPNV 的抗原表位位于基因VP2 和VP3 上，而VP2 基因含有主要的抗原表位，因此常用VP2 研发疫苗。Park等[22]比较了IPNV VP2 和VP3 的免疫原性，发现VP3 更具有免疫原性。因此，IPN 基因工程疫苗的研制有两种方法：一是构建VP2 或者VP3 的重组蛋白制备疫苗，二是构建VP2-VP3 融合蛋白制备疫苗。IPN 的基因工程疫苗包括：DNA 疫苗、重组亚单位疫苗以及活载体疫苗。

3.1 DNA 疫苗

DNA 疫苗是指利用基因工程技术构建的重组质粒，通过不同递送系统使其在动物体内表达，使机体发生免疫反应而起到保护效果[23]。DNA 疫苗比重组亚单位疫苗制备更简单，不需要在体外表达，构建重组质粒后，可以利用感受态细胞进行扩繁，然后大量提取重组质粒，制备成本低、周期短，成为研究最多的疫苗。本文从DNA 疫苗的免疫方式即注射疫苗和口服疫苗两个方面总结了已经报导的DNA 疫苗。

3.1.1 注射疫苗

Mikalsen 等[24]基于IPNV 的多聚蛋白基因（含VP2 和VP3）、VP2 的前端、VP2 的中心部分、VP2 的后端、VP2 以及VP3 构建了6 种质粒。将6 种质粒通过肌肉注射分别接种大西洋鲑。结果仅有含IPNV 多聚蛋白基因组的质粒获得了较好的保护效果，相对保护率达到84%，而VP2 作为主要的抗原基因并没有良好的保护效果，可能是因为通过截短的方式获取VP2 时造成了连续表位的丢失。De Las Heras 等[25]将VP2 插入到pcDNA3.1 表达载体中，该重组质粒可以减少IPNV 感染后的细胞病变效应以及病毒载量。免疫褐鳟（Salmo trutta）后，相关免疫基因的表达量急剧增加，还能检测到IPNV 特异性抗体。Cuesta 等[26]将IPNV A 片段多聚蛋白开放阅读框（ORF）插入到pcDNA3.1 表达载体中，构建了针对IPNV 的DNA 疫苗（pIPNV-PP）。该疫苗可明显减少虹鳟体内IPNV 病毒载量。Xu 等[27]将IHNV的糖蛋白基因和IPNV 的VP2-VP3 克隆到pcDNA3.1 表达载体中，对IHNV 和IPNV 混合感染有明显的保护作用。该疫苗接种剂量小，只需要1 μg质粒DNA 就可为虹鳟提供良好的保护效果。Ahmadivand 等[28]用带有PTA 基序的VP2 的DNA 疫苗免疫4～5 g 的虹鳟，结果显示出88%的相对保护率。带有PTA 基序的IPNV 无毒，虽然不具毒性，但病毒仍具有抗原性，可以用于研制高效的DNA 疫苗。

3.1.2 口服疫苗

口服疫苗比注射疫苗接种更方便，对幼鱼无损伤，更合适小鱼的大规模接种。口服给药后，疫苗中的抗原基因首先要经过消化道，为了保证疫苗不被完全消化而顺利通过消化道，需要采取一定的保护方法[29]。在IPN 口服疫苗的研发中，通常采用藻酸盐、脂质体以及壳聚糖等疫苗递送载体保护抗原基因，保证抗原基因不被降解而被鱼苗充分吸收，达到免疫效果。

用藻酸盐微球将质粒DNA 包裹，可以避免疫苗在消化道被消化，顺利进入鱼体前肠和后肠，保证疫苗被充分吸收。De Las Heras 等[30]用藻酸盐微球胶囊封装带有VP2 的DNA 疫苗，保护效果可达80%。Ballesteros 等[31]发现，藻酸盐口服DNA 疫苗诱导的保护机制与IPNV 感染诱导的防御机制相似，而口服疫苗诱导的相关免疫因子上调量更高。将该疫苗和饲料混合后连续喂养虹鳟3 d，对虹鳟的相对保护率可达85.9%[32]。该研究表明将疫苗与饲料混合投喂是一种很有效的接种方式。

脂质体是由双层磷脂组成的球形封闭结构，能包裹质粒DNA 而起到保护抗原的作用，广泛应用于疫苗的研究中[33]。Reyes 等[34]用阳离子脂质体将DNA 疫苗制成丸剂连续喂养虹鳟5 d，相对保护率可达66%，明显好于肌肉注射（47.8%）。壳聚糖也是口服疫苗的载体之一[33]。Ahmadivand 等[35]用壳聚糖/ 三聚磷酸（chitosan/tripolyphosphate，CS-TPP）纳米颗粒包裹质粒DNA，以每尾鱼10 μg DNA 和25 μg DNA 的剂量口服免疫虹鳟鱼苗，相对保护率为47%和70%。在口服相同剂量的CS-TPP 纳米颗粒和藻酸盐微球配制的DNA 疫苗后，相对保护率上升为59%和82%。这些结果表明了CS-TPP 纳米颗粒作为口服疫苗递送载体的潜力，与藻酸盐微球胶囊配合使用效果更佳。

3.2 重组亚单位疫苗

重组亚单位疫苗是指利用相应的表达载体，使抗原基因在对应的表达系统中表达，获得使机体产生特异性免疫或非特异性免疫的抗原蛋白[19]。目前用于IPNV 亚单位疫苗的原核表达系统包括大肠杆菌表达系统和乳酸杆菌表达系统；真核表达系统包括昆虫细胞表达系统和酿酒酵母表达系统。

大肠杆菌表达系统是研制重组亚单位疫苗最常用的表达系统，具有制备周期短、成本低、蛋白产量高、技术成熟等优点。乳酸杆菌是肠道里的有益菌，是一种安全的微生物，代表菌株有干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）等，以乳酸杆菌为表达系统的口服疫苗安全性会更好。利用酵母和昆虫细胞表达的VP2 和VP3蛋白，可以形成一种病毒样颗粒（virus-like particles，VLP）。VLP 具有与天然病毒相似的三级结构，能够更有效地诱导抗IPNV 反应[36]。与VLP 相似的还有亚病毒颗粒（subviral particles，SVP）。它们具有病毒的自身免疫原性和生物活性，但是不带有病毒的遗传物质，不具有传染性，是一种安全有效的疫苗形式。

3.2.1 大肠杆菌表达系统

Manning 和Leong[37]用质粒pTA1 在大肠杆菌中表达了IPNV A 段编码的完整cDNA，获得了大量IPNV 蛋白。用细菌裂解物浸泡免疫虹鳟，攻毒后虹鳟的死亡率为4%，而对照组死亡率达到44%。该研究说明亚单位疫苗可以为鱼苗提供实质性的保护。Frost 等[38]在大肠杆菌中表达了重组VP2 蛋白，可在大西洋鲑体内产生IPNV 特异性抗体。Dadar 等[39]构建了IPNV VP2-VP3 融合基因的重组质粒，利用大肠杆菌表达系统在体外表达，获得了高产量的VP2-VP3 重组蛋白。用该重组蛋白注射方式虹鳟，相对保护率可达83%。Tamer 等[13]利用大肠杆菌表达IPNV VP2 蛋白，结合ISA 763A 佐剂制备重组亚单位疫苗，对虹鳟的相对保护率为70%。

3.2.2 乳酸杆菌表达系统

刘敏等[40]利用pPG1 表达载体在干酪乳杆菌中表达了IPNV VP3 基因，为之后研制乳酸杆菌口服疫苗奠定了基础。Zhao 等[41]构建了pPG1-VP2-VP3 重组质粒，在干酪乳杆菌表达，获得了pPG1-VP2-VP3 重组蛋白。该疫苗可诱导虹鳟体内产生特异性抗血清IgM，并降低IPNV 在虹鳟体内的载量。这些研究表明，乳酸杆菌表达系统可用作疫苗设计。刘佳琪等[42]从虹鳟肠道中分离出了一种植物乳杆菌，并利用分离出的植物乳杆菌表达了IPNV VP2-VP3重组蛋白，经过初次免疫和加强免疫后，对虹鳟的保护率可达100%，表明利用虹鳟体内分离出来的宿主菌研制疫苗的保护效果更好，为口服疫苗的开发提供了新的思路。Duan 等[43]在干酪乳杆菌的疫苗基础上加入虹鳟趋化因子CK6，诱导了虹鳟体内更强烈的特异性免疫反应，保护效果更好。Chen 等[29]在加入了CK6 疫苗的基础上添加嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）黏附基因（AHA1）。将AHA1 作为肠上皮细胞的靶向分子，能黏附在上皮细胞并延长抗原在肠道内的保留时间，增强乳酸菌疫苗的免疫原性。在加入AHA1 后，口服免疫能更迅速、更精确地将IPNV VP2 蛋白送到肠上皮细胞，使机体产生显著水平的抗IPNV 血清IgM 和黏膜IgT 抗体应答。干酪乳杆菌在和靶向分子、趋化因子联合使用后，保护效果良好。但是构建乳酸杆菌疫苗通常使用抗生素耐药性作为选择性标志物，会对生物安全构成威胁。Hua 等[44]去掉了pPGF-612 中的氯霉素基因，将其作为载体在干酪乳杆菌中表达了以EGFP 绿色荧光蛋白为标记的CK6-VP2 融合蛋白，该疫苗可有效抑制IPNV 在虹鳟体内的复制。在未来的一段时间，乳酸杆菌疫苗的研制主要以无抗生素疫苗为主。

3.2.3 酵母表达系统

Allnutt 等[45]在酿酒酵母中表达了IPNV VP2 基因，VP2 基因在酵母中形成了一种20 nm 的SVP。将rVP2-SVP 通过注射和口服两种途径接种虹鳟，检测到了IPNV 特异性抗体，用IPNV Buh 毒株对虹鳟攻毒，接种疫苗组病毒载量比对照组更低。该研究证明了SVP 作为疫苗开发的潜力。Dhar 等[46]将人类致癌基因c-myc 插入到IPNV VP2 蛋白自组装的SVP 中，在酿酒酵母中成功表达，并在虹鳟体内诱导了抗IPNV 免疫反应。贺文斌[47]建立了IPNV酵母表面展示系统，将IPNV VP2 蛋白在酵母表面成功表达，用该疫苗免疫虹鳟发现，免疫虹鳟IgM、IgT、CD4、CD8 等免疫基因均显著上调；虹鳟体内IPNV 载量显著降低。这些结果表明，酿酒酵母是一种非常好的疫苗表达系统，以酿酒酵母研发的IPNV 口服疫苗具有较好的免疫效果。

3.2.4 昆虫细胞表达系统

昆虫表达系统是将抗原基因整合到杆状病毒中，随杆状病毒在昆虫细胞中大量繁殖获得高产量的蛋白。杆状病毒的宿主专一性强，通常不会造成实验室的污染，安全性较高[35]。Shivappa 等[48]利用杆状病毒在昆虫细胞和幼虫中表达了IPNV 的A 片段，获得了高产量的IPNV 蛋白，结构蛋白自组装形成VLP。用获得的VLP 抗原加上油佐剂制成疫苗免疫大西洋鲑，相对保护率为27%。该研究结果表明，昆虫表达系统可用于IPNV 疫苗的研制。

3.3 活载体疫苗

活载体疫苗是将抗原基因通过基因工程技术插入到弱毒或者无毒的毒株中构建重组病毒。重组病毒可通过浸泡或者自然感染的方式将目的基因运送到宿主体内，随着重组病毒在宿主体内不断繁殖，目的基因也随之不断表达，诱发相应的免疫反应[49]。Guo 等[50]用IPNV VP2 基因和VP2 CEO 基因替代IHNV 的NV 基因，构建了两种重组病毒（rIHNV-IPNV VP2 和rIHNV-IPNV VP2 COE），两种重组病毒对虹鳟鱼苗的保护效果可达50%～65%。Chen 等[51]用IPNV 的VP2 基因取代了rIHNV 主链的NV 基因，构建rIHNV-N438A-ΔNV-VP2 重组病毒。该重组病毒对IPNV Sp 血清型感染的相对存活率可达88.9%。Zhao 等[52]将IPNV 的VP2 基因插入到IHNV U 型基因组的Blk94 毒株的P 和M 基因之间，构建了rBlk94-VP2 重组病毒。该重组病毒可显著降低IPNV 在脾脏、肝脏和前肾中的载量。以上研究都表明，IHNV 的弱毒毒株可作为活疫苗开发的载体，保护虹鳟免受两种或多种疾病的感染，广泛应用在IPN 疫苗研制中。Li 等[53]将VP2 基因整合到腺病毒中，该重组病毒在人胚肾细胞（human embryonic kidney cells，HEK-293）中成功表达VP2基因。用重组病毒浸泡免疫虹鳟，相对保护率可达88.24%。以腺病毒为载体开发出的IHNV 和IPNV的二联活载体疫苗，浸泡免疫虹鳟，IPNV 攻毒后的相对存活率可达86.84%[54]。

活载体疫苗接种方便，可通过自然感染的方式接种鱼苗，容易引起群体免疫。在进入宿主体内后，抗原基因会随着载体在体内复制，可以引起长时间的免疫反应，且免疫效果好，这些优势让活载体疫苗成为一类新型疫苗。

4 展望

近年来，IPN 的暴发使我国鲑鳟鱼养殖业遭受到了严重的阻碍。大多数疫苗停留在实验室水平，没有商业化产品投入市场。目前，IPN 灭活疫苗的制备技术已经成熟，最佳灭活方式、最佳接种剂量以及最佳免疫方式已经确定，最有可能成为首批商业化疫苗。与此同时，基因工程疫苗已取得突破性进展。基因工程是新时代的产物，各地区对基因工程疫苗的态度以及政策各不相同，其应用受到一定得限制。随着人们对渔用疫苗的认识加深及基因工程的飞速发展，将有希望获得更加便捷、安全、高效的IPN 疫苗，促进鲑鳟鱼养殖业的健康发展。