彭 东，赖玉健，田柬昕，钟碧銮，安苗青，黎 攀，3，杜 冰，3*

（1 华南农业大学食品学院 广州 510642 2 广东参之源健康科技有限公司 广州 510000 3 华南农业大学与官栈鱼胶营养安全研究中心 广州 510642）

鱼鳔位于硬骨鱼体腔内的背部，是鱼维持平衡的重要器官。在鱼类加工过程中，鱼鳔经常被作为废弃物处理，造成资源的浪费，鱼鳔的高值化利用引起人们的关注[1]。鱼鳔在我国有着悠久的食用和药用历史，最早的食用文字记录可追溯到北魏时期的《齐民要术》，药用文字记录可追溯到唐朝的《本草拾遗》。鱼鳔的主要成分为胶原蛋白，鱼鳔多肽是胶原蛋白的酶解产物，具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳和抗癌等多种功效[2-4]。

前列腺癌是全球男性最常见的恶性肿瘤之一[5]。在我国，前列腺癌的发病率和死亡率呈逐年增高的趋势，前列腺癌的防治是我国公共卫生当前面临的重大挑战[6]。抗癌肽具有易获得性、生物相容性、高效性和低毒性等多种优点，在癌症治疗中表现出巨大的潜力[7]。研究表明抗癌肽的作用机制主要包括：参与诱导癌细胞周期停滞、诱导癌细胞凋亡、抗癌细胞血管新生、抑制肿瘤干细胞和激活机体免疫应答[8-10]。课题组前期测得黄鱼鱼鳔中蛋白质含量高达75%以上，是生产胶原蛋白肽的优质原料来源[11]。本试验从黄鱼鱼鳔酶解产物中分离纯化抗前列腺癌肽，探究其对前列腺癌细胞DU-145 细胞的作用效果，并推测诱导细胞凋亡的机制，以期明确黄鱼鱼鳔肽抗前列腺癌的作用机制，同时也为黄鱼鱼鳔的高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干制黄鱼鱼鳔，购买于当地海鲜市场；前列腺癌细胞DU-145 细胞、DU-145 细胞专用培养基，武汉普诺赛生命科技有限公司；胰蛋白酶消化液、二甲基亚砜，美国Amresco 公司；二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA），美国Sigma 公司；AO/EB染色试剂盒、Annexin V-FITC 试剂盒、PI 试剂盒、BCA 蛋白质定量检测试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；CCK-8 试剂，广州松鼠生物科技有限公司；Bax、Caspase-3、Caspase-9 和β-actin抗体，美国Cell Signaling Technology 公司；中性蛋白酶、碱性蛋白酶，广州柏棠贸易有限公司；Sephadex G-25 凝胶填料、DEAE-52 凝胶填料，北京瑞达恒辉科技发展有限公司；其余试剂为分析纯级。

1.2 仪器与设备

LC-20AT 高效凝胶渗透色谱仪、1260 高效液相色谱仪、1290-6470 超高压液质联用色谱仪，美国Agilent 公司；CytoFLEX 流式细胞仪，美国Beckman Coulter 有限公司；VarioskanTM LUX 多功能酶标仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；TCS SP8 激光共聚焦荧光显微镜，德国Leica 公司；Alpha 2-4 LD plus 真空冷冻干燥机，德国Christ 公司。

1.3 方法

1.3.1 黄鱼鱼鳔酶解液的制备[12]黄鱼鱼鳔清洗去除杂质→料液比1 ∶20 浸泡4 h →NaOH 调pH 值至8.5 →加0.75%碱性蛋白酶、0.25%中性蛋白酶→55 ℃恒温酶解4 h →升温至90 ℃保持10 min 灭酶→冷却至室温→4 000 r/min 离心15 min →取上清→鱼鳔酶解液→真空浓缩、冷冻干燥得到鱼鳔多肽冻干粉。将多肽冻干粉送至广东省测试分析研究所进行多肽分子质量测定。

1.3.2 鱼鳔多肽的纯化 取鱼鳔多肽冻干粉溶于蒸馏水中，配置成质量浓度为10 mg/mL 的溶液，使用中空纤维超滤膜（1 ku）过滤，收集<1 ku 的组分，冻干备用。将收集到的组经Sephadex G-25 凝胶色谱柱进一步纯化。蒸馏水作为洗脱液，每管流速为0.7 mL/min，用自动收集器收集洗脱液。采用微量紫外分光光度计测定洗脱液吸光值，收集单峰组分，真空浓缩、冷冻干燥。测定组分对DU-145细胞的抑制率。

Sephadex G-25 凝胶交换柱纯化后的组分经DEAE-52 阴离子交换柱进一步纯化。分别采用纯水、0.1 mol/L、0.2 mol/L NaCl 溶液为洗脱液，每管流速为2 mL/min，每管收集体积为5 mL。测定每管收集的洗脱液的吸光值，收集后冻干单峰组分。测定组分对DU-145 细胞的抑制率。

DEAE-52 阴离子交换柱纯化后的组分经反相高效液相色谱（Reversed-phase high performance liquid chromatography，RT-HPLC）进一步纯化。色谱条件设置如下：Pursuit XRs C-18 色谱柱（250 mm×21.2 mm，10 μm），A 相——含0.1%三氟乙酸的水，B 相——含0.1%三氟乙酸的乙腈；流速为1 mL/min，色谱柱温度为35 ℃，紫外检测器的波长为280 nm。梯度洗脱条件如下：A 相：0～12 min，95%→80%；12～24 min，80%→5%。按顺序收集单峰组分，浓缩后真空冻干。测定各组分对DU-145 细胞的抑制率，对抑制率最高的组分进行序列鉴定。

1.3.3 鱼鳔多肽序列鉴定 在待鉴定组分中加入DTT 溶液使其终浓度为10 mmol/L，56 ℃水浴中还原1 h，加入IAA 溶液使其终浓度为50 mmol/L，避光反应40 min 后，脱盐，并于45 ℃条件下在真空离心浓缩仪中使溶剂挥干。在使用LC-MS/MS 检测前用10 mL 0.1%甲酸中重悬。色谱条件如下：ReproSil-Pur C18-AQ resin（1.9 μm，100 Å）填充色谱柱（150 μm×15 cm），进样体积5 μL，A相——含0.1%甲酸的水，B 相——含0.1%甲酸的乙腈，流速为600 nL/min。梯度洗脱条件如下：A 相：0～2 min，96% →92%；2～45 min，92% →72%；45～55 min，72%→60%；55～66 min，60%→5%。质谱条件：样品用Q ExactiveTMUHMR 组合型四极杆OrbitrapTM质谱仪分析，电压为2.2 kV，温度为270℃，CID 检测器，母离子扫描范围m/z100～1 500。

1.3.4 鱼鳔多肽对DU-145 细胞的抑制率测定DU-145 细胞用DU-145 专用培养基培养，在37℃、5% CO2条件下培养细胞单层生长至铺满瓶底80%左右时进行传代或用于试验。取100 μL 对数生长期DU-145 细胞以2×105个/mL 浓度接种于96 孔板，培养24 h 后加入10 μL 鱼鳔多肽样品，孵育24 h 后加入10 μL CCK-8 溶液，反应2 h，用酶标仪在波长450 nm 处测定吸光度。抑制率计算公式如式（1）。

式中，A0——培养基+CCK-8 溶液的吸光值；A1——细胞+CCK-8 溶液的吸光值；A2——细胞+样品+CCK-8 溶液的吸光值。

1.3.5 AO/EB 法测定DU-145 细胞凋亡 取对数生长期DU-145 细胞以2×105个/mL 浓度接种于6 孔板中，每孔2 mL，培养24 h 后更换培养液，分别加入含有50，250 μg/mL 和750 μg/mL 鱼鳔多肽的培养液，空白组加入原始培养液，继续培养24 h。取出6 孔板，吸去上清液，PBS 洗涤2 次，弃去洗涤液。加入10 μL AO/EB 混合液（VAO：VEB=1∶1），室温下避光孵育5 min，激光共聚焦荧光显微镜下观察并拍照。

1.3.6 流式细胞仪测定细胞凋亡 取对数生长期DU-145 细胞以2×105个/mL 浓度接种于6 孔板中，分别加入含50，250 μg/mL 和750 μg/mL 鱼鳔多肽的培养液，空白组加入原始培养液，培养48 h。2 500 r/min 条件下离心5 min 收集沉淀，加入4℃预冷PBS 溶液，于2 500 r/min 下离心5 min，收集沉淀，重复两次。加入500 μL 结合缓冲溶液重悬细胞后，加入5 μL Annexin V-FITC 溶液，避光反应5 min 后，加入5 mL PI 溶液，避光静置5 min。用300 目筛网过滤，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.7 流式细胞仪测定细胞周期 取对数生长期DU-145 细胞以2×106个/mL 浓度接种于6 孔板中，分别加入含50，250 μg/mL 和750 μg/mL 鱼鳔多肽的培养液，空白组加入原始培养液，培养48 h。2 500 r/min 条件下离心5 min，收集细胞，用4℃预冷PBS 洗涤细胞2 次后，加入1 mL 20 ℃的70%乙醇，吹打均匀后静置过夜。2 500 r/min 条件下离心5 min，弃掉上清液，用4 ℃预冷PBS 洗涤细胞后，每管细胞加入0.5 mL PI 染色液，37 ℃避光放置30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

1.3.8 细胞凋亡蛋白表达 利用试剂盒提取细胞总蛋白，并利用BCA 蛋白质定量检测试剂盒进行定量。利用免疫印记法测定Bax、Caspase-3 和Caspase-9 蛋白在DU-145 细胞中的表达量。

1.4 数据分析

测定值以平均值±标准差表示，试验重复3次。使用SPSS 22 软件进行单因素方差分析，通过LSD 法对数据进行多重字母比较分析。采用OriginPro 9.0 软件进行图形可视化处理，ChemDraw8.0 软件绘制多肽结构。

2 结果与分析

2.1 鱼鳔酶解液分子质量

采用HPGPC 检测鱼鳔酶解液分子质量，结果如表1所示。酶解后的鱼鳔多肽中分子质量大于1 000 u 的多肽占比36.73%，分子质量小于1 000 u 的多肽占比63.27%，其中小分子多肽占比率较高，表明鱼鳔蛋白酶解程度较好。

表1 鱼鳔酶解产物分子质量Table 1 Molecular weight of enzymatic hydrolysate of yellow croaker swim bladder

2.2 鱼鳔多肽的分离纯化

鱼鳔酶解产物经Sephadex G-25 凝胶层析柱纯化的洗脱曲线如图1a所示。在图1a 中，只出现一个峰，表明仅有一种分子质量大小相近的多肽被洗脱下来，命名为YCSB。考察YCSB 对前列腺癌细胞DU-145 的抑制效果，结果如图1b所示。随着YCSB 质量浓度变大，抑制率也随之增强，呈现一定的质量浓度依赖性。当YCSB 质量浓度为1 000 μg/mL 时，抑制率为28.4%，对DU-145 细胞表现出一定的抑制作用，可推断出YCSB 中存在抗前列腺癌肽。

图1 鱼鳔多肽的分离纯化Fig.1 Separation and purification of peptide from yellow croaker swim bladder

选用DEAE-52 阴离子交换层析柱来对YCSB 进行纯化，得到的洗脱曲线如图1c～1e。纯水洗脱曲线中仅有一个峰，收集并命名为YCSB-1；0.1 mol/L NaCl 洗脱曲线中有一高一低2 个峰，收集高峰组分命名为YCSB-2；0.2 mol/L NaCl 洗脱曲线中也出现了2 个峰，收集高峰组分命名为YCSB-3。图1f 为YCSB-1、YCSB-2 和YCSB-3 对DU-145 细胞的抑制率，在1 000 μg/mL 时，YCSB-1 抑制率最高，为48.3%。因此，对YCSB-1进行进一步纯化。

图1g 为YCSB-1 的RT-HPLC 色谱图，峰型较好，分离效果较佳。图谱中出现6 个不同的色谱峰组分，收集并分别命名为YCSB-1a、YCSB-1b、YCSB-1c、YCSB-1d、YCSB-1e 和YCSB-1f。这6个组分对DU-145 细胞的抑制率如图1h所示，在1 000 μg/mL 时，YCSB-1c 表现出最高的抑制率（45.8%），表明YCSB-1c 是YCSB-1 中一种重要的抗前列腺癌肽。

2.3 多肽氨基酸序列鉴定

将YCSB-1c 通过LC-MS/MS 分析，对采集到的高分辨质谱数据进行De novo 测序，共检测出2 条四肽（表2）。图2 为2 条四肽的二级质谱图，SPSP 的氨基酸序列为丝氨酸-脯氨酸-丝氨酸-脯氨酸（Ser-Pro-Ser-Pro），GPAR 的氨基酸序列为甘氨酸-脯氨酸-丙氨酸-精氨酸（Gly-Pro-Ala-Arg）。

表2 YCSB-1c 的氨基酸序列鉴定Table 2 Amino acid sequence identification of YCSB-1c

图2 多肽的二级质谱图Fig.2 The secondary mass spectrum of peptide

2.4 AO/EB 染色

吖啶橙（AO）能透过细胞膜完整的细胞，将细胞核染成均匀的绿色荧光；而溴化乙锭（EB）只能透过细胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，使其发出橘红色荧光[13]。因此，可以利用AO/EB 染色法来辨别正常细胞和凋亡细胞，YCSB-1c 作用后DU-145 细胞的AO/EB 染色结果如图3所示。图3a 为空白组，细胞呈现均匀的绿色荧光，表明空白组中存在大量活细胞。图3b、3c 和3d 分别对应YCSB-1c 的低（50 μg/mL）、中（250 μg/mL）和高质量浓度（750 μg/mL）组，随着YCSB-1c 质量浓度增加，活细胞数量不断减少，凋亡细胞数量不断增加，表明YCSB-1c 能诱导DU-145 细胞凋亡，且作用效果呈现质量浓度依赖性。

图3 YCSB-1c 作用后DU-145 细胞的AO/EB 染色图Fig.3 AO-EB staining of DU-145 cells after treatment with YCSB-1c

2.5 细胞凋亡分析

细胞经Annexin V-FITC/PI 双染后，使用流式细胞仪能够准确地区分细胞的凋亡状态分布[14]。YCSB-1c 作用DU-145 细胞24 h 后，细胞的线粒体膜电位图如图4所示，图中4 个象限表示细胞的不同状态：左上，坏死细胞；左下，正常细胞；右上，晚期凋亡细胞；右下，早期凋亡细胞。相较于空白组，YCSB-1c 组中凋亡细胞明显增多，其中早期凋亡细胞在50 μg/mL 和250 μg/mL YCSB-1c 组中有微小的增加，而在750 μg/mL YCSB-1c 组中早期凋亡细胞明显增加，达到10.92%。50，250 μg/mL 和750 μg/mL YCSB-1c 组中的晚期凋亡细胞占比分别为7.97%，14.44%和16.25%，较空白组（1.80%）分别提升了342.78%，702.22%和802.78%。YCSB-1c 促使DU-145 细胞进入凋亡状态，且作用效果与质量浓度呈正相关，这与细胞的AO/EB染色结果一致。

图4 YCSB-1c 对DU-145 细胞凋亡的影响Fig.4 The effect of YCSB-1c on the apoptosis of DU-145 cells

2.6 细胞周期分析

细胞周期可分为4 个阶段：G1 期（DNA 合成前期）、S 期（DNA 合成期）、G2 期（DNA 合成后期）、M 期（细胞分裂期）。YCSB-1c 作用后DU-145 细胞的细胞周期情况如图5 和表3所示。由表3 可知，与空白组相比，YCSB-1c 组中G0/G1期细胞显著增多（P<0.05），且呈现质量浓度依赖性；S 期和G2/M 期细胞显著降低（P<0.05），这表明YCSB-1c 将DU-145 细胞的细胞周期阻滞在G0/G1 期，阻止细胞进入S 期合成DNA，进而诱导DU-145 细胞凋亡。

图5 YCSB-1c 作用后DU-145 细胞的细胞周期分布图Fig.5 Cell cycle distribution profiles of DU-145 cells after treatment with YCSB-1c

表3 YCSB-1c 作用后DU-145 细胞的细胞周期分布结果Table 3 Cell cycle distribution results of DU-145 cells after treatment with YCSB-1c

2.7 免疫印记检测蛋白表达

Bax是一种促凋亡基因，能激活细胞线粒体凋亡途径，而Caspase-3 和Caspase-9 是执行凋亡的两种关键蛋白酶[15]。如图6所示，3 种凋亡蛋白条带清晰，无明显拖尾。与空白组相比，不同质量浓度YCSB-1c 组中Bax、Caspase-3 和Caspase-9蛋白表达量增加，且呈质量浓度依赖性（表4）。这表明YCSB-1c 能上调Bax、Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表达，进而促使DU-145 细胞凋亡。

表4 YCSB-1c 作用后DU-145 细胞中蛋白表达量Table 4 Protein expression content in DU-145 cells after treatment with YCSB-1c

图6 YCSB-1c 作用后DU-145 细胞中蛋白表达Fig.6 Protein expression in DU-145 cells after treatment with YCSB-1c

3 讨论

生物活性肽的功能与其特定氨基酸组成有密切关系，本研究分离纯化得到的鱼鳔多肽YCSB-1c 中含有2 条四肽，分别为SPSP（Ser-Pro-Ser-Pro）、GPAR（Gly-Pro-Ala-Arg），其组成氨基酸均是黄鱼鱼鳔蛋白中的优势氨基酸[11]。Pro 是2 条四肽中共有的氨基酸，在SPSP 中占比高达50%，其是构成抗癌肽的重要氨基酸成分，如Huang 等[16]从蛏子中分离出两条多肽Leu-Pro-Gly-Pro 和Asp-Tyr-Val-Pro，并证实它们具备较好的抗前列腺癌活性；Shamova 等[17]从山羊白细胞中分离一条富含Pro 的多肽ChBac3.4，其能选择性地作用K562 红血病细胞和U937 囊性淋巴瘤细胞而不损伤人体正常细胞。此外，GPAR 中的Gly、Arg 也被公认为是抗癌肽的主要氨基酸组成[18-19]。

细胞周期与细胞凋亡有着紧密的关联，细胞凋亡导致活细胞数量下降，引起细胞周期发生改变[20]。流式细胞仪检测YCSB-1c 作用后DU-145细胞的细胞周期发现，与空白组相比，YCSB-1c 组中G0/G1 期细胞显著增多（P<0.05），S 期和G2/M期细胞显著降低（P<0.05）。YCSB-1c 将DU-145细胞周期阻滞在G0/G1 期，这可能与细胞合成DNA、核糖体和蛋白质受阻有关[21]。Huang 等[16]研究发现，抗前列腺癌肽SCH-P10 作用后DU-145细胞中G0/G1 期细胞数量增加，S 期和G2/M 期细胞数量减少，与本研究的结果一致。

诱导癌细胞凋亡被认为是治疗癌症的有效手段。细胞凋亡主要包括线粒体凋亡、内质网应激和死亡受体凋亡3 种途径[22]，其中线粒体凋亡途径主要由非Caspase 依赖细胞凋亡诱导因子和细胞色素C 介导[23]。细胞凋亡诱导因子介导的凋亡途径为：药物引起线粒体内的细胞凋亡诱导因子释放，并转移到细胞核内，破坏细胞DNA 进而导致细胞凋亡[24]。细胞色素C 介导的凋亡途径为：当细胞中促凋亡蛋白Bax 被激活时，会引起线粒体膜通透性增加，线粒体内的细胞色素C 被释放到细胞质中，激活细胞中凋亡蛋白酶激活因子（Apaf-1），Apaf-1 能激活Caspase-9[25]。细胞色素C、Apaf-1 和caspase-9 通过形成凋亡小体激活Caspase-3，使核酸内切酶活化，引起DNA 断裂最终导致细胞凋亡[26]。本研究中发现，YCSB-1c 作用后DU-145 细胞中促凋亡蛋白Bax、执行凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9 表达上调，推测YCSB-1c诱导DU-145 细胞凋亡的作用机制如图7所示。

图7 YCSB-1c 诱导DU-145 细胞凋亡的作用机制Fig.7 The mechanism of YCSB-1c inducing apoptosis of DU-145 cells

综上所述，YCSB-1c 能将DU-145 细胞的细胞周期阻滞在G0/G1 期，促使DU-145 细胞中Bax、Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表达上调，最终诱导DU-145 细胞凋亡，实现抗前列腺癌的功效。试验结果表明黄鱼鱼鳔肽具有成为抗前列腺癌药物的潜力。后续将人工合成黄鱼鱼鳔中的两条寡肽，研究它们对前列腺癌细胞的抑制效果和作用机制。

4 结论

本文从黄鱼鱼鳔酶解产物分离得到鱼鳔肽YCSB-1c，其包含Ser-Pro-Ser-Pro 和Gly-Pro-Ala-Arg 两条寡肽。YCSB-1c 对前列腺癌细胞DU-145 有较好的抑制效果，其机制为：将DU-145 细胞的细胞周期阻滞在G0/G1 期，抑制细胞增殖；上调促凋亡蛋白Bax、执行凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9 的表达量，诱导细胞凋亡。本研究为黄鱼鱼鳔的抗前列腺癌保健品开发提供数据支持，并有效提高黄鱼鱼鳔的附加值。