气相色谱法分析牛乳粉中碘成分的定值方法

2023-03-20白晓云苏运聪张耀广李兴佳黄亚芳

乳业科学与技术 2023年1期

白晓云，苏运聪，张耀广，李兴佳，李飞，黄亚芳*

（君乐宝乳业集团有限公司，农业农村部乳品质量安全控制重点实验室，河北石家庄 050021）

碘作为一种维持人体甲状腺正常功能的微量元素，与人类的健康息息相关，成年人体内含有20～50 mg的碘[1-2]。适量摄入碘可以促进生物氧化、调节蛋白质合成和分解、促进糖和脂肪代谢、调节水盐代谢[3-4]、促进维生素的吸收利用、增强酶的活力、促进生长发育[5-8]。对于婴幼儿而言，婴幼儿配方乳粉是补充碘的主要来源，建立准确、可靠的检测方法，研制确保检测方法准确的标准物质具有非常重要的意义。

目前检测碘的方法有电感耦合-等离子体质谱法、氧化还原滴定法、砷铈催化分光光度法及气相色谱法等[9-11]，其中，电感耦合-等离子体质谱法适用于食品中碘的测定[12-13]；氧化还原滴定法适用于藻类及其制品中碘的测定[14-15]；砷铈催化分光光度法适用于粮食、蔬菜、水果、豆类及其制品、乳及乳制品、肉类、鱼类及蛋类食品中碘的测定[16-17]；气相色谱法适用于婴幼儿配方食品和乳品中营养强化剂碘的测定[18-20]，气相色谱分析技术具有分离速度快、灵敏度高等特点，电子捕获检测器能很好地分离和检测碘，并且前处理过程较为简单，分离效果好，是一种最常用的常规方法[21-23]。

本研究对气相色谱法前处理过程中使用试剂的用量、衍生过程、仪器条件进行优化，得到稳定的实验结果，针对“牛乳粉中碘”检测需求，研制基体标准物质，对产品日常检测起到质量控制作用，且可用于实验室日常质量控制的评价[20,24-25]，该定值方法的建立对科研人员及检测人员有一定借鉴意义，能够为碘的检测和质量控制提供科学依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳粉：市售。

标准物质：水中碘离子溶液标准物质（GBW（E）082815）中国计量科学研究院；亚铁氰化钾（分析纯）、2-丁酮（分析纯）、过氧化氢（分析纯）天津市大茂化学试剂厂；乙酸锌（分析纯）天津市光复科技发展有限公司；硫酸（分析纯）成都市科隆化学品有限公司；正己烷（色谱纯）迪马科技有限公司。

1.2 仪器与设备

GC-2010 Plus气相色谱仪（配备电子捕获检测器）、SH-Rtx-5毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）日本岛津公司；VORTEX-5涡旋混合器美国Scientific Industries公司；BSA224S电子天平赛多利斯科学仪器有限公司；JJ600电子天平常熟市双杰测试仪器厂；Milli-Q超纯水制备系统美国Millipore公司；BGZ-246恒温干燥箱上海博讯医疗生物仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

称取混合均匀的固体试样2.5 g（精确至0.000 1 g）于100 mL锥形瓶中，用25 mL约40 ℃的热水溶解。将上述处理过的试样溶液转入50 mL容量瓶中，加入2.5 mL 109 g/L亚铁氰化钾溶液和2.5 mL 219 g/L乙酸锌溶液后，用水定容至刻度，充分振摇后静置10 min。过滤吸取滤液10 mL于100 mL分液漏斗中，加入10 mL水。向分液漏斗中加入0.7 mL体积分数98.3%硫酸、0.5 mL质量分数100%丁酮和1.5 mL体积分数3.5%双氧水，充分混匀，室温下保持20 min，加入20 mL正己烷，振荡萃取2 min。静置分层后，将水相移入另一分液漏斗中，再进行第2次萃取，合并有机相，用水洗涤2～3 次。通过无水硫酸钠过滤脱水后移入50 mL容量瓶中，用正己烷定容，为试样测定液。

1.3.2 气相色谱仪器条件

色谱柱：固定相5%苯基-95%甲基聚硅氧烷，弱极性柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），或相当者，参考色谱柱SH-Rtx-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；载气流速1.0 mL/min；进样量1 μL；升温程序：初始温度50 ℃，保持9 min，之后以30 ℃/min的速率升至220 ℃，保持3 min；分流比1∶1；检测器温度300 ℃；进样口温度260 ℃。

1.3.3 标准溶液配制

碘标准贮备液（100 mg/L）配制：GBW（E）082815水中碘离子溶液标准物质。

碘标准工作液（1.0 mg/L）配制：准确移取1.0 mL碘标准贮备液，用水定容至100 mL容量瓶中，混匀。

1.3.4 标准曲线的绘制

分别向50 mL容量瓶中加入碘标准工作液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL，加入2.5 mL 109 g/L亚铁氰化钾溶液和2.5 mL 219 g/L乙酸锌溶液后，用水定容至刻度，充分振摇后静置10 min。过滤吸取滤液10 mL于100 mL分液漏斗中，加入10 mL水。后续步骤与1.3.1节样品处理步骤一致，得到碘标准曲线。

1.3.5 标准物质均匀性研究

根据JJF 1006—1994《一级标准物质技术规范》的要求对标准物质进行均匀性实验，根据JJF1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》的要求，对于总体单元数（n），200＜n≤500时，抽取样品数不少于15 个，从标准物质包装中不同部位随机抽取15 个单元样品，做标准物质均匀性统计检验，每个单元取样量为2.5 g，进行3 次平行测定，采用本研究建立的气相色谱法进行测定，以随机次序进行测定，以防止测量系统的时间变差干扰均匀性评估，通过随机化样品瓶的顺序，同时结合改变样品测量顺序来达到目的，对测量的数据进行方差分析，通过组间方差和组内方差的比较来判断不同单元乳粉中碘含量的测量值之间有无系统性差异[26-27]。

1.3.6 标准物质稳定性研究

稳定性是标准物质的基本属性，用于描述标准物质的特性值随时间变化的性质，即描述标准物质特性的时间分布特征。按照JJF 1343—2012，稳定性评估的方案可以分为经典稳定性评估和同步稳定性评估，本研究中长期稳定性评估采用经典稳定性评估方案，短期稳定性评估采用同步稳定性评估方案[28-29]。1.3.7 乳粉中碘含量结果计算

式中：X为乳粉中碘含量/（mg/kg）；m1为从标准曲线中查得试样中碘的质量/μg；m2为称样量/g；n为稀释倍数。

1.4 数据处理

采用Excel、Origin软件对所涉及到的数据和图谱进行处理和绘制。

2 结果与分析

2.1 不同前处理条件对碘检测峰面积的影响

2.1.1 丁酮用量对碘检测峰面积的影响

选择丁酮的用量为0.1、0.5、1.0、1.5、3.0 mL，由图1可知，丁酮用量为0.5 mL时，碘的峰面积最大，表明碘衍生反应比较彻底，因此，丁酮用量为0.5 mL最佳。

图1 丁酮用量对碘检测峰面积的影响Fig.1 Effect of butanone dosage on the peak area of iodine

2.1.2 硫酸用量对碘检测峰面积的影响

选择硫酸的用量为0.3、0.5、0.7、1.0、1.5 mL，由图2可知，硫酸用量为0.7 mL时，碘的峰面积最大，而且比较稳定，因此，硫酸用量0.7 mL最佳。

图2 硫酸用量对碘检测峰面积的影响Fig.2 Effect of sulphuric acid dosage on the peak area of iodine

2.1.3 双氧水用量对碘检测峰面积的影响

选择双氧水的用量为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，由图3可知，双氧水用量为1.5 mL时，碘的峰面积最大，因此，双氧水用量1.5 mL最佳。

图3 双氧水用量对碘检测峰面积的影响Fig.3 Effect of hydrogen peroxide dosage on the peak area of iodine

2.1.4 衍生时间对碘检测峰面积的影响

选择衍生时间为10、20、30、40 min，由图4可知，衍生时间为20 min时，碘的峰面积最大，而且比较稳定，因此，衍生时间20 min最佳。

图4 衍生时间对碘检测峰面积的影响Fig.4 Effect of derivatization time on the peak area of iodine

2.2 气相色谱仪检测条件对碘检测结果的影响

2.2.1 不同检测器温度对碘检测结果的影响

选择检测器温度290、300、310 ℃进行优化，由表1可知，检测器温度为300 ℃时，峰宽较窄，峰形良好，碘的峰面积最大，因此，检测器温度300 ℃为最佳。

表1 不同检测器温度条件下对应的目标物峰宽和峰面积Table 1 Peak width and peak area of iodine at different detector temperatures

2.2.2 升温速率对碘检测结果的影响

程序升温是指色谱柱的温度按设置的程序连续地随时间线性或非线性逐渐升高，以使低沸点组分和高沸点组分在色谱柱中都有适宜的保留、色谱峰分布均匀且峰形对称。程序升温具有改进分离、使峰变窄、检测限下降及节约时间等优点。本研究对10、20、30、40 ℃/min升温速率进行优化，由表2可知，升温速率30 ℃/min条件下的峰面积高于升温速率10、20、40 ℃/min，因此，本研究选择：初始温度为50 ℃，保持9 min，之后以30 ℃/min的速率升至220 ℃，保持3 min。

表2 不同升温速率对应的峰面积Table 2 Peak area of iodine at different heating rates

2.2.3 分流比对碘检测结果的影响

样品浓度大时，调整分流比，可以改善峰形。分流比通常按照经验设置，以取得分析灵敏度和色谱峰形的良好平衡。如果分流比太低，峰形将变宽，可能由于超载而表现出前置行为。如果分流比太高，进入色谱柱的样品太少，分析的灵敏度随峰面积一同减少。本研究选择分流比0.5∶1、1∶1、2∶1和10∶1进行优化，由图5可知，分流比为1∶1时的峰形比较好，因此，选择分流比为1∶1。

图5 分流比为11∶1时的色谱图Fig.5 Chromatogram with 1:1 split ratio

2.2.4 初始温度对碘检测结果的影响

初始温度会影响峰高、峰宽、分离度等，选择初始温度为40、50、70 ℃进行优化，当初始温度为40 ℃和70 ℃时，目标物的出峰位置处杂峰较多，不利于碘的分析。由图6可知，初始温度50 ℃时，目标物可以清晰分离，在保证样品所有组分均能气化完全且目标峰分离效果良好的前提下，选择初始温度为50 ℃。

图6 初始温度为50 ℃时的色谱图Fig.6 Chromatogram at initial temperature of 50 ℃

2.2.5 进样口温度对碘检测结果的影响

进样口温度需要设置为能使样品全部气化的温度，选择240、260、280 ℃进行优化，由表3可知，进样口温度为240、260、280 ℃时，峰宽和峰面积几乎没有什么变化，对实验结果无显著影响，在保证目标物完全气化的前提下，选取进样口温度为260 ℃。

表3 不同进样口温度条件下对应的目标物峰宽和峰面积Table 3 Peak width and peak area of iodine at different inlet temperatures

2.3 标准曲线

为了考察该方法线性，用碘标准工作液配制成质量浓度分别为2、4、8、16、24 ng/mL的标准溶液进行衍生，以检测到的峰面积（y）和质量浓度（x）进行线性回归。得到线性回归方程为y=17 100x+4 331（R2=0.999 6）。表明在2～24 ng/mL质量浓度范围内，仪器对碘具有良好的线性响应，满足基体标准物质定值要求。

2.4 精密度和加标回收率

随机抽取3 瓶乳粉样品，每瓶称取2 个子样，测定6 个乳粉子样中碘的含量。由表4可知，6 个乳粉子样中碘含量的相对标准偏差为2.3%，小于10%，表明该方法的精密度良好。

表4 乳粉中碘含量测定结果（nn==66）Table 4 Results of determination of iodine content in milk powder (nn = 6)

采用标准添加法，选择碘含量较低的乳粉作为本底，分别在本底样品中加入乳粉中碘含量的25%、50%、125%，每个添加水平平行测定3 次，根据样品的测定结果计算加标回收率。由表5可知，3 个不同加标水平的加标回收率分别为95.3%、101.3%和98.8%，表明该定值方法准确、可靠。

表5 乳粉中碘加标回收率实验结果Table 5 Recoveries of iodine from spiked milk powder

2.5 检出限

为进一步考察方法的检出限，将衍生后的样品用水稀释后上机测定，进样量1 μL，经过气相色谱仪测定，结果如图7所示，根据软件积分自动计算信噪比。以3 倍信噪比为检出限，得到该定值方法的检出限为0.2 mg/kg。

图7 不同质量浓度时碘衍生后色谱峰信噪比Fig.7 Signal to noise ratio of chromatographic peak of sample derivatized with iodine at different concentrations

2.6 定值方法应用的结果分析

2.6.1 均匀性

随机选取15 个碘定值样品，每个样品做3 次平行实验，检验样品制备的均匀性，结果如表6所示。由均匀性检验数据可得F分布变量为1.89，根据自由度及给定的显著性水平（α）=0.05，组数（m）=15，个数（n）=45，可由F分布临界值查表得临界Fα，Fα（m-1，n-m）=F0.05（14，30）=2.32，F＜Fα，表明组内与组间无明显差异，样品均匀。