刘 琳，朱文娟，韩晓云，孔 婧，李梦洋，孙庆申,*

（1.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150500；2.黑龙江大学生命科学学院 黑龙江省普通高等学校微生物重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080；3.黑龙江大学生命科学学院 黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080）

黑木耳是我国重要的可食用真菌，产量大、滋味鲜美，被誉为“素中之荤”，其蛋白质、脂肪、膳食纤维、多糖含量分别为10.00%～16.20%、0.31%～0.70%、51.92%～57.57%、13.42%～28.90%[1]。黑木耳中的膳食纤维等多种功能因子具有调节人体自身免疫、抗氧化、抗衰老、降血脂、降血糖、抑菌及预防动脉粥样硬化等多种功能[2-6]，对其进行深度开发具有重要意义。

1953年，Hipslay提出“膳食纤维”的概念，认为膳食纤维是多糖和木质素细胞壁的化学混合物[7]。膳食纤维来源广泛，主要包括水果、蔬菜、坚果及谷物等[8-9]，具有预防心血管疾病、肥胖、糖尿病及肠癌[10-14]等作用，被认为是一种新的保健食品原料，在食品中有广泛的应用价值[15]。此外，膳食纤维还能促进肠道有益菌的生长活性（益生元活性）[16]。研究表明，膳食纤维作为益生元对调节肠道微生态和促进人类健康具有重要意义。

发酵乳不仅口感好，而且富含蛋白质、脂肪、维生素等多种营养元素，具有很高的营养价值。在发酵过程中乳中营养物质的转化不仅促进了风味的形成，还可改善肠道菌群结构，减轻乳糖不耐症等，因而发酵乳产品倍受消费者的青睐[17]。发酵乳虽然营养丰富，但是缺乏膳食纤维[18]，对于一些亚健康人群或对健康有特定需求的人群而言，仅仅食用普通的发酵乳是远远不够的。在发酵乳中加入膳食纤维，开发功能性发酵乳，是当前研究的热点[19]。

将黑木耳不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）添加到牛乳中生产发酵乳，充分发挥2 种原料的优势，特别是黑木耳膳食纤维的益生元活性和发酵乳作为益生菌载体的能力，开发黑木耳膳食纤维发酵乳产品，市场前景广阔，可进一步提高乳制品的营养价值和应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑木耳、完达山脱脂乳粉、伊利全脂纯牛乳（250 mL）和白砂糖均购于哈尔滨中央红超市。

羧甲基纤维素钠（carboxy methyl cellulose，CMC）河南万邦实业有限公司；纤维素酶 北京博奥拓达科技有限公司；发酵剂 丹尼斯克（中国）有限公司；实验中所用到的其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JM-F65胶体磨 上海台驰轻工装备有限公司；AVATAR370傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy）仪 美国赛默飞世尔科技公司；H1850台式高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；JA3003N精密电子天平 上海精密科学仪器有限公司；YT-DBZ蛋白质测定仪 山东科技有限公司；PB40X2-166F破壁机 广洲电器有限公司；PB-10 pH计赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；W201恒温水浴锅上海申胜生物技术有限公司；TA.XT Express物性仪英国Stable Micro Systems公司；PHS-3C pH计 上海雷磁实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳IDF的制备

参考付娆等[20]的方法制备黑木耳IDF。黑木耳清洗干净，55 ℃烘干，将干木耳加入清水（1∶40，m/V）泡发后，破壁机处理，然后胶体磨研磨至黑木耳浆发白即可。用纤维素酶（添加量0.9%）进行酶解，调节pH值为5.0，温度为50 ℃，酶解3.5 h。酶解结束后，100 ℃水浴灭酶5 min。室温冷却后将酶解液再次过胶体磨进行研磨，然后1 699×g离心10 min，收集沉淀，得到黑木耳IDF。

1.3.2 黑木耳IDF理化性质分析

1.3.2.1 膨胀力

按照Wang Lei等[21]的方法测定IDF的膨胀力，称取干燥至恒质量的黑木耳IDF样品0.50 g置于20 mL刻度试管中（样品干质量记为m），读取干品体积（V1），并向其中加入10 mL蒸馏水，充分搅拌以除去溶液中的气泡，振荡均匀后置冰箱中过夜。准确读取膨胀后试管中物料体积（V2），IDF膨胀力按式（1）计算。

1.3.2.2 持水力

参照Wang Lei等[21]的方法，称取干燥至恒质量的黑木耳IDF样品0.50 g于50 mL离心管中（样品干质量记为m0，离心管质量记为m1），向其中加入20 mL蒸馏水，充分搅拌使样品均匀分散于离心管中，密封后置于冰箱中过夜，1 699×g离心25 min，弃去上清液，用滤纸吸干管壁残留水分，吸水后样品和离心管质量记为m2，IDF持水力按式（2）计算。

1.3.2.3 持油力

参照Chau等[22]的方法，称取干燥至恒质量的黑木耳IDF样品0.50 g于50 mL离心管中（样品干质量记为m0，离心管质量记为m1），向其中加入10 mL食用油，振荡摇匀，室温下静置1 h，然后1 699×g离心20 min。立即弃去上清液，擦干离心管内外壁所附着的油脂，吸油后样品和离心管质量记为m2。IDF持油力按式（3）计算。

1.3.3 黑木耳IDF FTIR分析

称取黑木耳IDF干样2 mg，准确称取200 mg溴化钾粉末在105 ℃条件下烘干至恒质量，二者混合均匀，研磨后进行压片处理，利用FTIR仪在4 000～500 cm-1进行扫描，得到FTIR图。

1.3.4 黑木耳IDF发酵乳的制备及质量检测

将CMC、脱脂乳粉、白砂糖分别按照质量浓度2、1.5、7 g/100 mL添加到发酵乳体系中，酶解得到的黑木耳IDF溶液添加量分别为体积分数0%、6%、7%、8%、9%、10%，搅拌均匀后90 ℃巴氏杀菌10 min，将其冷却至42 ℃时加入市售发酵剂（由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌组成），在42 ℃条件下发酵，至发酵终点时，将发酵乳放置于4 ℃冰箱内后熟并保存。每个样品设置3 个平行。

1.3.4.1 pH值和酸度

在发酵期间，每隔2 h测定1 次pH值和酸度，直至发酵终点。采用pH计测定pH值；酸度的测定参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》。

1.3.4.2 乳酸菌活菌数

参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 乳酸菌检验》，采用MRS平板记数法进行乳酸菌活菌数的测定。

1.3.5 黑木耳IDF发酵乳配方优化单因素及正交试验

1.3.5.1 单因素试验

固定CMC添加量为1.5%，脱脂乳粉添加量为2%，发酵时间6 h，白砂糖添加量为7%，对黑木耳IDF溶液添加量（0%、6%、7%、8%、9%、10%）进行单因素试验；固定白砂糖添加量为7%，黑木耳IDF溶液添加量为8%，脱脂乳粉添加量为2.0%，发酵时间6 h，对CMC添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）进行单因素试验；固定白砂糖添加量为7%，CMC添加量为1.5%，黑木耳IDF溶液添加量为8%，发酵时间6 h，对脱脂乳粉添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）进行单因素试验。考察每个单因素对发酵乳感官评分的影响，确定黑木耳IDF发酵乳的工艺配方。

1.3.5.2 正交试验

在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验优化黑木耳IDF发酵乳工艺条件。以黑木耳IDF添加量、CMC添加量、脱脂乳粉添加量作为考察因素，设计3因素3水平的正交试验，同样以感官评分为指标，每个实验重复3 次，取平均值作为结果，对黑木耳IDF发酵乳工艺进行优化。正交试验因素水平如表1所示。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Levels of independent variables used for orthogonal array design

1.3.6 模糊数学法评价发酵乳品质模型建立

参照GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》，采用模糊数学法，以感官评分为指标，对黑木耳IDF发酵乳配方进行优化。过程如下：选取20 位同学（男女各半，22～25 岁）组成评价小组，以发酵乳的组织状态、口感、风味及色泽为评定指标（表2），根据对黑木耳IDF发酵乳的组织状态、口感、风味和色泽的重要性进行两两比较打分，得到权重集为X={0.23，0.31，0.26，0.20}，根据感官评定表得出模糊矩阵R，发酵乳的感官评分Y=X×R。

表2 黑木耳IDF发酵乳感官评价标准Table 2 Criteria for sensory evaluation of fermented milk with added Auricularia auricula IDF

黑木耳IDF发酵乳各理化指标检测：脂肪含量、蛋白质含量、微生物指标均按照国标 GB 19302—2010《食品安全国家标准 发酵乳》进行检测。

1.3.7 发酵乳贮藏期内活菌数及持水力测定

按照发酵乳的制作工艺流程制备发酵乳，分别于0、1、7、14、21 d对发酵乳的持水力、乳酸菌活菌数进行测定，每个样品设置3 个平行。

离心管洗净擦干，称质量记为m1，取一定量的发酵乳于离心管中，称取发酵乳和离心管质量记为m2，955×g离心10 min，离心结束后，将离心管慢慢倾斜，轻轻倒掉上清液，对离心后的发酵乳和离心管进行称质量，记为m3，持水力按式（4）计算。

1.3.8 发酵乳贮藏期内质构特性测定

采用物性仪测定发酵乳的硬度、弹性、咀嚼性和胶黏性等质构特性。具体操作如下：选择发酵结束（0 d），以及贮藏1、7、14、21 d的发酵乳进行全质构分析测定，采用P/36R探针；设置参数为：测试距离15.0 mm，探针速率为测前5.0 mm/s、测中2.5 mm/s、测后2.0 mm/s，感应力5.0 g。注意在测试过程中探针不要碰壁，以免影响测试结果的准确性，每个样品设置3 个平行。

1.4 数据处理

使用Origin 9.1软件的单因素方差分析对实验所得数据进行统计学分析，所有数据以平均值±标准差的形式表示，显著性比较采用Fisher检验。

2 结果与分析

2.1 黑木耳IDF理化性质分析

膳食纤维的高持水力可用作功能性成分，例如，防止食物脱水收缩和改变其黏度，以及改进某些配方食品的质地[20-22]。本研究得到的黑木耳IDF的膨胀力为（18.31±0.08） mL/g，持油力为（8.91±0.11） g/g，持水力为（21.40±0.45） g/g，可以看出，黑木耳IDF理化性质优异，优于同类产品[23]，这可能与黑木耳本身具有很好的吸水能力有关。

由图1可知，3 418.56 cm-1处出现的宽展圆滑的吸收峰是由多糖亚甲基中O—H的伸缩振动形成的，说明黑木耳IDF中含有较多的羟基及结合水分子，2 932.09 cm-1处是多糖亚甲基中C—H的伸缩振动特征吸收峰，这2 个峰的出现表明纤维素和半纤维素具有典型的结构[24]。1 200～1 400 cm-1是C—H的变角振动，在这些区域的吸收峰是糖类的特征吸收峰。1 000～1 300 cm-1出现多个小尖峰组成的强宽峰，这可能是由于伯醇的混合振动或糖环的C—O—H和C—O—C振动引起的[25]。而1 037 cm-1附近的峰为C—O—C键上的C—O拉伸振动峰，为典型的木聚糖吸收峰，这表明膳食纤维成分中含有木聚糖半纤维素[23]。896.06 cm-1处为纤维素中β-D-葡萄糖苷键的吸收峰，是纤维素的特征结构峰。

图1 黑木耳IDF的FTIIRR图Fig.1 FTIR spectrum of Auricularia auricula IDF

2.2 黑木耳IDF添加量对发酵乳发酵过程的影响

2.2.1 pH值

在发酵乳发酵过程中，pH值可以作为一项重要的参考指标来反映发酵乳中乳酸菌的生长情况。由图2可知，在发酵之前，不同添加量的IDF已导致发酵乳的起始pH值下降，这与Szajnar等[26]报道的结果相似。发酵前2 h，膳食纤维组的pH值开始显著下降，且低于对照组，2 h后pH值继续下降，显著低于对照组（P＜0.05），发酵5.5 h时，膳食纤维组pH值降至4.6左右，到达发酵终点，符合发酵乳最终pH值的要求，而对照组pH值略高，膳食纤维组pH值始终低于对照组。由此可见，添加黑木耳IDF可以缩短发酵乳发酵时间，提高产酸速率。后熟12 h后，各IDF添加量膳食纤维组间无显著性差异。

图2 黑木耳IDF对发酵乳发酵过程pH值的影响Fig.2 Effect of Auricularia auricula IDF on pH value of fermented milk during fermentation

2.2.2 酸度

益生菌利用碳源发酵产生短链脂肪酸、乳酸等弱酸性物质，由于弱酸无法完全电离，导致一部分氢离子无法被pH值衡量，因此利用酸度作为衡量发酵乳发酵的指标能够与pH值互补，更准确地反映发酵程度[27]。由图3可知，在发酵之前，膳食纤维组和对照组的起始酸度都在20 °T左右。发酵前2 h，膳食纤维组的酸度开始显著上升，与pH值变化一致；发酵2 h时，对照组酸度达到60 °T，而膳食纤维组酸度达到70 °T左右，明显高于对照组；此后酸度继续上升，发酵5.5 h时达到发酵终点，膳食纤维组酸度100 °T左右，明显高于对照组，此时，对照组与膳食纤维组之间酸度具有显著性差异，而膳食纤维组各添加量之间差异不显著。后熟12 h结束时，除IDF溶液添加量为6%的发酵乳酸度显著高于其他各组外（P＜0.05），其余各组酸度差异不显著。由此可见，黑木耳IDF的添加在一定程度上促进了有机酸的转化。实验过程中发现黑木耳IDF对乳酸菌具有增殖作用，而乳酸菌的生长过程中会利用多糖类物质进行发酵产生乳酸及其他有机酸类，因此呈现酸度上升现象[25,28]。

图3 黑木耳IDF对发酵乳发酵过程酸度的影响Fig.3 Effect of Auricularia auricula IDF on acidity of fermented milk during fermentation

2.2.3 发酵乳乳酸菌活菌数

由表3可知，随着黑木耳IDF添加量的升高，发酵乳乳酸菌活菌数增加。当添加量为7%时，乳酸菌活菌数达到最大值，此后，黑木耳IDF添加量升高，乳酸菌活菌数减少。当黑木耳IDF添加量为9%和10%时，发酵乳乳酸菌活菌数低于对照组。这说明添加黑木耳IDF在一定范围内可以促进乳酸菌的增殖，膳食纤维可以促进一些微生物生长，是由于这些微生物可以利用纤维成分作为能量底物进行发酵，所产短链脂肪酸进一步促进微生物的生长[26-28]。

表3 黑木耳IDF对发酵乳乳酸菌活菌数的影响Table 3 Effect of Auricularia auricula IDF on the number of viable bacteria in fermented milk

2.3 黑木耳IDF发酵乳配方优化结果

2.3.1 单因素试验结果

2.3.1.1 黑木耳IDF添加量对发酵乳感官评分的影响

由图4可知，随着黑木耳IDF添加量增加，感官评分先上升后下降，当黑木耳IDF添加量为7%时，发酵乳滋味、色泽及组织状态都比较好，感官评分最高。随着黑木耳IDF添加量增加，出现凝乳不均匀、组织状态粗糙、色泽加深的现象。原因是膳食纤维添加量过高时，酸化速度加快，使得黏度增加，质地粗糙，口感和风味有所下降，发酵乳感官评分降低，所以选定黑木耳IDF添加量为7%。

图4 黑木耳IDF对发酵乳感官评分的影响Fig.4 Effect of Auricularia auricula IDF on sensory evaluation score of fermented milk

2.3.1.2 脱脂乳粉添加量对发酵乳感官评分的影响

由于黑木耳IDF是以液体的形式添加到发酵乳中，带入了一定的水分。所以需要加入一定量的脱脂乳粉改善发酵乳的稠度，以保证发酵乳中适宜的乳固形物含量，同时可以起到稳定发酵乳蛋白质含量的作用。由图5可知，脱脂乳粉添加量对发酵乳的感官品质有比较明显的影响，当脱脂乳粉添加量为2.0%时，发酵乳口感均匀细腻，乳香味适宜，感官评分最高。

图5 脱脂乳粉添加量对发酵乳感官评价的影响Fig.5 Effect of skim milk powder addition on sensory evaluation score of fermented milk

2.3.1.3 CMC添加量对发酵乳感官评分的影响

为了使黑木耳IDF发酵乳色泽、质地均一稳定，需加入稳定剂进行改善。CMC在水中有很好的溶解性，并能形成弱凝胶，稳定蛋白质，使脂肪充分乳化，因此在乳制品工业中CMC常被用作稳定剂和增稠剂。尤其是在酸性乳饮料中，酪蛋白容易发生聚集失稳，CMC可以作为一种多糖保护酪蛋白，具有增加发酵乳品质稳定性及口感滑腻性的作用。由图6可知，随着CMC添加量增加，感官评分先上升后下降，当添加量低于1.0%时，发酵乳凝乳状态差，产生分层现象。添加量高于2.0%时，发酵乳过于黏稠，口感不清爽。当添加量为1.5%时，发酵乳凝乳均匀、结构稳定、爽口不黏口，此时感官评分最高。

2.3.2 正交试验结果

由表4可知，以感官评分为指标，由K值大小可知，黑木耳IDF发酵乳最优组合为A2B2C2，由极差值大小可知，各因素对发酵乳感官品质的影响主次顺序为A＞B＞C，即黑木耳IDF添加量对发酵乳的感官影响最大，主要影响发酵乳的色泽和口感；CMC次之，主要影响发酵乳的质地和色泽；脱脂乳粉添加量影响最小，主要影响发酵乳的稠度和口感。然后对此进行验证实验，该条件下得到的发酵乳感官评分为9.1 分，均优于其他实验组，因此确定最佳配方为黑木耳IDF添加量7%、CMC添加量1.5%、脱脂乳粉添加量2.0%。

表4 发酵乳配方正交试验结果与分析Table 4 Orthogonal array design with sensory evaluation score of fermented milk

表5 发酵乳配方正交试验结果方差分析Table 5 Analysis of variance for the effect of Auricularia auricula IDF, skim milk powder and CMC on the sensory evaluation score of fermented milk

通过单因素及正交试验优化黑木耳IDF发酵乳配方，得到黑木耳IDF添加量为7%、CMC添加量1.5%、脱脂乳粉添加量2.0%，该条件下制得的发酵乳感官评分最高，色泽、质地均一稳定。

2.4 黑木耳IDF发酵乳产品质量指标

制得的黑木耳IDF发酵乳呈浅灰色，色泽均匀一致；表面光滑细腻，无乳清析出，凝乳质地致密，黏稠度好；口感细腻，无颗粒感，酸甜比例适宜，具有发酵乳固有的风味。蛋白质含量为（3.53±0.08）%，脂肪含量为（3.12±0.03）%，灰分含量为（0.78±0.12）%，固形物含量为（19.35±0.49）%，各项指标均达到发酵乳卫生标准GB 19302—2010的规定水平。大肠菌群未检出，符合GB 19302—2010有关规定。

2.5 发酵乳贮藏期间活菌数、持水力及质构特性的变化

2.5.1 活菌数

由图7可知，贮藏0 d时，黑木耳IDF发酵乳中的总活菌数初始值显著高于对照组。贮藏1 d时，对照组和黑木耳IDF组发酵乳活菌数均有所上升，贮藏7 d时，2 组发酵乳活菌数均有所下降。贮藏7～14 d，黑木耳IDF组活菌数明显上升，而对照组活菌数明显下降。此后，对照组和黑木耳IDF组发酵乳活菌数均有所下降，但最终黑木耳IDF组活菌数高于对照组。在整个贮藏期间，黑木耳IDF发酵乳活菌数始终高于对照组发酵乳。黑木耳IDF的添加可以在一定程度上促进乳酸菌的增殖，这与Safdari等[19]报道的结果一致。

图7 发酵乳贮藏期间活菌数的变化Fig.7 Changes in the number of viable bacteria in fermented milk during storage

2.5.2 持水力

由图8可知，2 组发酵乳的持水力都随着贮藏时间的延长而逐渐下降，但在整个贮藏期间，黑木耳IDF发酵乳的持水力始终高于对照组，这与Dong Ruihong等[29]的报道一致。这是因为发酵乳的持水力受其中酪蛋白的含量影响较大，酪蛋白在发酵条件下可形成网状空间胶体结构，此结构可将更多的水分子和小分子物质包裹住。添加一定量的黑木耳IDF后，由于其结构中含有大量亲水基团，进一步增强了发酵乳中酪蛋白胶体颗粒的网络结构，从而抑制了乳清析出，提高了发酵乳的持水力，这一结果与Luo Xianliang等[30]的报道一致。

图8 发酵乳贮藏期间持水力的变化Fig.8 Changes in the WHC of fermented milk during storage

2.5.3 质构特性

由表6可知，黑木耳IDF的添加显著增加了发酵乳贮藏期间的硬度、咀嚼性和胶黏性，这可能是由于黑木耳IDF中的有益成分影响了发酵乳中乳酸菌的发酵，改变了发酵乳中酪蛋白分子间的相互作用，进而促进或抑制酪蛋白的相互凝集作用，造成硬度、咀嚼性和胶黏性的变化[31]。在贮藏期间，发酵乳的硬度会先增加，这与范宇等[32]的研究结果一致，但是在贮藏后期，随着发酵乳持水力的下降，乳清析出严重，硬度下降，这与胡锦涛等[33]的研究结果一致。黑木耳IDF发酵乳的弹性与对照组没有明显差别。

表6 黑木耳IDF发酵乳贮藏期间质构特性的变化Table 6 Texture properties of yogurt supplemented with Auricularia auricula IDF

3 结 论

黑木耳IDF的添加可以促进发酵乳产酸，有效缩短发酵乳的发酵时间；不同添加量的黑木耳IDF对发酵乳pH值和酸度的影响无显著差异，但与对照组相比则有显著差异，当黑木耳IDF添加量为7%（换算成冻干粉含量为0.78%）时，发酵乳活菌数最高。黑木耳IDF发酵乳最优工艺配方为黑木耳IDF、CMC和脱脂乳粉添加量分别为7%、1.5%和2.0%，该条件下制备的黑木耳IDF发酵乳各项指标都符合国标要求。对黑木耳IDF发酵乳的贮藏期稳定性进行分析发现，在整个贮藏期间，黑木耳IDF发酵乳的活菌数始终高于对照组发酵乳，并且持水性等质构性能也优于对照组发酵乳。