周 艳，赵存朝，杨舒雯，陶 亮，田 洋

（1.大理农林职业技术学院，云南 大理 671003；2.云南农业大学，云南 昆明 650500；3.云南农业职业技术学院，云南 昆明 650031）

辣木（Moringa oleifera Lam） 为辣木科辣木属植物，是一种具有独特经济价值的热带植物[1]，2012 年，国家卫生和计划生育委员会将辣木叶批准为新食品原料[2]。研究表明，辣木叶含有丰富的蛋白质、维生素，以及钾、钙、铁等矿质元素，黄酮、酚类、有机酸等多种活性物质[3]。根据国内外的研究文献报道，辣木叶干粉中钙含量高达2 500～3 000 mg/100 g，比同量牛乳中钙含量高约4 倍[4]。同时，辣木具有调节血压、降血糖、抗氧化、抑菌消炎、抗癌及增强免疫等生理功效[5-6]，可开发成辣木保健饮料、乳饮料、畜禽饲料和鱼饲料等。

钙作为一种极其重要的常量元素，占人体体重的1.2%～1.5%，在机体的物质代谢及生命的维持过程中发挥着重要作用[7]。钙是中国居民缺乏严重程度排名第一的营养素，目前市场上的钙营养强化剂可以分为3 类：无机钙营养强化剂、有机钙营养强化剂和生物钙营养强化剂。碳酸钙、氧化钙均呈碱性，必须在胃中与大量胃酸反应生成离子钙后才能被吸收[8]，有机钙营养强化剂溶解性好，对胃肠刺激性小，卫生安全性高，但普遍存在着含钙量低和有不同程度毒副作用等缺点。生物钙以氨基酸鳌合钙和肽鳌合钙为代表，主要产品有甘氨酸鳌合钙、胶原多肽鳌合钙等，能以整体形式被小肠吸收，吸收率高，补钙的同时还补充了蛋白质和氨基酸，一举两得[9]。沈延等人[10]利用米曲霉生长代谢所产生的蛋白酶水解虾皮中的蛋白质，产生促钙吸收的肽、氨基酸，并与虾皮发酵过程中产生的游离钙离子螯合成肽钙螯合物。结果表明，直接发酵产生的游离钙与水解生成的肽螯合成肽钙，肽钙得率达到0.625%±0.01%。

近年来，随着生活水平和健康意识的提高，补充钙元素的植物饮料备受消费者欢迎[11]，但是，目前以植物为原料开发的钙产品较少。主要原因是植物中的钙含量较少，同时由于植酸、草酸的存在，与钙离子结合影响人体对钙的吸收。通过发酵的方式可有效降低植物中植酸、草酸，释放钙离子，同时发酵可产生大量小分子多肽、氨基酸和多糖，其可与钙离子结合，形成利于人体吸收的小分子螯合钙。因此，以辣木叶原料，利用发酵技术提取辣木叶中的天然有机钙并与辣木多肽鳌合形成辣木肽钙鳌合物。以辣木叶提取物为主要原料，香橙粉、麦芽糊精、糖粉、酸味剂等为辅料，进行辣木高钙固体饮料配方研究，研制一种富含辣木天然有机钙的固体饮料，人体易吸收的补钙产品。为辣木叶深加工产品的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

辣木叶粉，云南天佑科技开发有限公司提供；天然橙粉，恒德堂植物原料提取厂提供；麦芽糊精，山东宏腾生物科技有限公司提供；冰乙酸、硼酸、乙醇胺、8 - 羟基喹啉、氢氧化钾，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。

菌种：嗜酸菌乳杆菌（CICC 20710）、酿酒酵母（CICC 31393）、罗伊氏乳杆菌（CICC 6226），中国工业微生物菌种保藏管理中心提供。

1.2 仪器与设备

电子天平，余姚市纪铭称重校验设备有限公司产品；高压灭菌锅，广州标际包装设备有限公司产品；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；落地式离心机，上海东华高压均质机厂产品；SP-1500 型实验型喷雾干燥机，上海辉展实验设备有限公司产品；凯氏定氮仪，上海祎鸿分析仪器有限公司产品；多功能酶标仪，Moleculart Devices 公司产品；生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 辣木有机钙制备

将辣木叶粉与去离子水混合，料液比为1∶15（g∶mL），于121 ℃下灭菌15 min，冷却至40 ℃，无菌条件下按菌种体积1∶2∶1 接种嗜酸菌乳杆菌、酵母菌和罗伊氏乳杆菌，总接种量为辣木液体积的8.0%，于37 ℃下发酵72 h，以转速4 500 r/min 离心20 min，上清液在进风温度为175 ℃、进料速度为700 mL/h 的条件下喷雾干燥，得到的辣木叶提取物在密封干燥环境中保存备用。

1.3.2 工艺设计

（1） 工艺流程。原料处理→杀菌→发酵→离心（以转速4 500 r/min 离心25 min） 上清液喷雾干燥→辅料（调配） →混匀→造粒→过筛（60 目） →干燥→成品。

（2） 操作要点。①粉碎。将天然橙粉、蔗糖、麦芽糊精、柠檬酸、苹果酸、蔗糖等辅料分别过100 目筛。②混合。将辅料分别称量后与一定量辣木叶提取物混合均匀，利用打粉机充分混匀。③造粒。喷洒适量水，置于混合机中搅拌5 min，制成湿料进行造粒。将造好粒的物料通过60 目的分样筛, 收集通过筛网的产品。④干燥。将物料置于50 ℃的干燥箱中干燥1～3 h，直至产品水分小于5%。⑤包装。每袋装8±2 g 为宜, 以方便消费者食用。

1.3.3 固体饮料配方研究

（1） 单因素试验。以固体饮料的感官评分为评价指标，分别对天然橙粉添加量（0，10%，20%，30%，40%）、蔗糖添加量（5%，10%，15%，20%，25%）、酸味剂（柠檬酸与苹果酸的配比为2∶5） 添加量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%） 进行单因素试验。以感官评分及溶解度为评价指标确定麦芽糊精添加量（5%，10%，15%，20%，25%）。

（2） 响应面优化。在单因素试验基础上，根据Box-behnken 的中心组合试验设计原理，以天然橙粉添加量（A）、麦芽糊精添加量（B）、酸味剂添加量（C） 及蔗糖添加量（D） 为自变量，以溶解后的感官评分为指标，设计四因素三水平的响应面优化试验。

响应面优化试验的因素与水平设计见表1。

表1 响应面优化试验的因素与水平设计 / %

1.3.4 感官评定

参考GB/T 15682—2008 的方法，选择年龄在20～45 岁的10 名男性和10 名女性。取10 g 固体饮料于无色透明玻璃杯中加入60 ℃纯净水100 mL，然后先观察色泽和闻气味，在进行品尝判断出产品色泽、气味、口感及组织状态并给出评分。根据每个评价员的评分结果计算平均值，个别品评误差大的可舍弃，舍弃后重新计算平均值[12]。最后评分的平均值，作为固体饮料的食用品质感官评价结果。

辣木高钙固体饮料的感官评分标准见表2。

表2 辣木高钙固体饮料的感官评分标准

1.3.5 理化指标测定

（1） 固体饮料的溶解性测定。采用离心沉淀法，精密称取10.0 g 辣木高钙固体饮料于50 mL 烧杯中，加入100 mL 蒸馏水，然后以转速3 000 r/min 离心30 min，弃去上清液，将沉淀物用GB 5009.3—2010直接干燥法干燥后称质量得m。固体饮料的溶解度根据下式计算。

式中： S——固体饮料的溶解性，%；

m——称量沉淀的总质量，g；

B——固体饮料的含水量，%。

（2） 固体饮料的吸湿性测定。将底部含有饱和氯化钠溶液的干燥器放置于25 ℃的恒温培养箱中24 h，此时干燥器内的相对湿度为75%。将调配好的固体饮料放置于鼓风干燥箱中，于105 ℃下干燥2 h 至衡质量。称取2 g 已衡质量的固体饮料粉末于平板上，放置于干燥器中。每隔24 h 取出，称其质量，直至吸湿平衡为止。以相对湿度75%吸湿平衡时的吸湿百分率表示吸湿性。吸湿率的计算公式为：

式中：m1——吸湿前质量，g；

m2——吸湿后质量，g。

（3） 钙鳌合率的测定。称取0.1 g 辣木叶提取物，加20 mmol/L 的Tris-HCl（pH 值7.2） 溶液5 mL，用漩涡振荡器混合均匀，以转速10 000 r/min 离心10 min，上清液中加入无水乙醇30 mL 静置沉淀，再以转速10 000 r/min 离心10 min，沉淀50 ℃下烘干并称量，采用邻甲酚酞络合比色法[13]测定沉淀中钙含量及样品中的钙含量。

（4） 其他理化指标测定。按照GB 5009.3—2016食品安全国家标准《食品中水分的测定》测定水分含量。

1.3.6 数据处理

采用Excel 2007，SPSS 19.0 对试验数据进行整理和制图，采用Expert Design 8.0.6 统计软件进行响应面优化分析。

2 结果与分析

2.1 固体饮料配方的确定

利用微生物发酵制备辣木有机钙，经喷雾干燥制备的辣木叶提取物食用口感较差。分别添加天然橙粉、麦芽糊精、酸味剂、蔗糖，以调节产品风味和口感。

辅料添加量对固体饮料感官评分及溶解度的影响见图1。

天然橙粉是由新鲜香橙干燥后粉碎制得的，添加到饮料中可使其具有香橙特有的风味，改善饮料口感。固体饮料的感官评分随天然橙粉添加量的增加而升高，添加量30%时平均感官评分值最大为78.5 分，但超过40%时开始下降饮料的口感越来越差，苦涩味突出。橙粉添加量过低辣木叶提取物的苦涩味和辣味突显出来使得固体饮料香气变淡，影响产品的口感，因此确定天然橙粉添加量为30%。

苹果酸是一种低热量添加剂，其酸度较柠檬酸强，但味道较柔和，代谢上有利于氨基酸吸收，不积累脂肪，被生物界和营养界誉为“最理想的食品酸味剂[14]。柠檬酸是酸性的护色剂，可以抑制酶促褐变的发生[15]，且对抗氧化剂具有增效作用。将柠檬酸与苹果酸配合使用，调节糖的甜度和辣木本身带有的辛辣味。由图1 可知，随着酸味剂添加量的增加感官评分先增大后减小；当酸味剂添加量为2.5%时其平均感官评分最高，达到85.25 分。这可能由于柠檬酸增加了酸度，使糖酸比失调，导致感官评分下降。因此，酸味剂添加量最宜为2.5%。

蔗糖作为甜味料，对固体饮料的口感和组织状态有着重要影响。当蔗糖添加量较少时，甜味不明显，如果蔗糖添加量过多，会增加产品黏度，降低口感。由图1 可知，产品感官品质随蔗糖添加量变化的趋势，蔗糖最佳添加量应为20%。

图1 辅料添加量对固体饮料感官评分及溶解度的影响

固体饮料主要辅料需要有即溶性、口感佳等特性，麦芽糊精甜度低、无异味、溶解性好、增稠性强[16]。在饮料、液态奶、冷饮中麦芽糊精可作为重要配料，能提高产品溶解性，增加黏稠感和实物感，同时还具有一定的乳化作用，对食品饮料的泡沫有良好的稳定作用[17]。当添加量为15%时，固体饮料溶解性最佳，溶解时不产生泡沫，液体澄清透明，口感醇厚感官评分达到78.45 分；当添加量为20%时，溶解度下降。因此，确定麦芽糊精添加量为15%。

2.2 响应面优化试验结果及分析

2.2.1 响应面设计及结果

响应面分析方案及结果见表3。

表3 响应面分析方案及结果

2.2.2 回归方程的建立及方差分析

回归模型的方差分析和失拟性分析见表4。

表4 回归模型的方差分析和失拟性分析

利用Design Expert 8.0.6 软件对响应面进行分析，建立辣木高钙固体饮料感官评分：天然橙粉添加量（A）、麦芽糊精添加量（B）、酸味剂添加量（C）、蔗糖添加量（D） 的二次方程模型为：

Y=91.57-1.43A+0.083B-1.77C-0.88D-0.45AB+1.75AC-2.76AD-0.37BC+0.88BD+2.13CD-3.52A2-3.15B2-4.10C2-2.20D2.

由表4 可知，F=12.9，p＜0.000 1＜0.01，所以该试验所选模型具有高度的显著性，失拟性检验F=1.99，p=0.377 3＞0.05，失拟项不显著，说明模型可以接受，即表明所选固体饮料感官评分二次回归模型可用于预测设定的参数。R2=0.928 0，R2adj=0.856 1说明该模型能够解释92.8%的试验数据变异性，拟合度较好。综上所述，回归模型拟合程度良好，试验误差小，能够准确分析和预测辣木高钙固体饮料的感官评分，试验操作可信度高。

2.2.3 配方参数优化和模型验证

经过响应面回归分析得到最佳参数为天然橙粉添加量29.4%，麦芽糊精添加量15.07%，酸味剂添加量2.34%，蔗糖添加量18.85%，在此优化条件下固体饮料的感官评分为92.08 分。在此最优条件下进行验证试验，重复3 次，配制的产品实际感官评分为89.8 分。

2.3 辣木叶有机钙的鳌合率

有机微量元素的螯合率，即螯合态元素的比例，研究有机微量元素螯合物产品的螯合率和络合强度与其在动物体内吸收代谢具有直接的相关性[18]。螯合率测定在衡量产品品质、改进生产工艺、研究微量元素作用机理等方面均有重要意义。

可溶性钙及可溶性钙结合量见图2。

图2 可溶性钙及可溶性钙结合量

通过测定辣木叶提取物中可溶解性钙及鳌合态钙含量，计算得到辣木高钙粉中钙的螯合率为47.69%，表明肽- 钙螯合物品质较好，且具有较好的螯合效果。近年来，蛋白质、肽促进钙吸收的效果被人们广泛关注[19]，蛋白质的降解产物（如氨基酸、多肽等）与钙的鳌合物稳定性好，是一种最接近自然界的盐的存在形式，在体内溶解性好，不易与植酸、草酸等有机酸结合而形成沉淀，从而阻止小肠内的钙发生沉淀，具有较好的促进钙吸收的能力，且鳌合钙能以整体的形式被小肠吸收，吸收率高，吸收速度快[20]。

2.4 固体饮料理化指标

辣木高钙固体饮料理化指标见表5。

表5 辣木高钙固体饮料理化指标/%

由表5 可知，辣木高钙固体饮料的水分含量符合《固体饮料卫生标准》对水分的要求，钙含量为0.41%，溶解度为90.24%、吸湿度为85.27%。

3 结论

以微生物发酵辣木叶制备辣木叶提取物，其中有机钙的螯合率为47.69%。通过响应面分析法确定辣木高钙固体饮料最佳配方为天然橙粉添加量29.4%，麦芽糊精添加15.07%，酸味剂添加量2.34%，蔗糖添加量18.85%。在此条件下产品感官评分为89.8 分。辣木高钙固体饮料钙含量为0.41%，水分含量为4.72%，溶解度为90.24%，吸湿性为85.27%。

产品为麦黄色，粉末状，无结块，均匀一致、细腻、无杂质。液态色泽为黄棕色，均匀一致，无杂质澄清透明有光泽，气味为香橙味，口感酸甜适中，香甜可口。辣木高钙固体饮料的研究为天然蛋白肽- 钙螯合物的研究开发奠定基础，提高辣木叶附加值。