李梦娇 石洪爽 王 威 武 昕 （中国医科大学附属第一医院妇科，沈阳110000）

外阴鳞状细胞癌（vulvar squamous cell carcinoma，VSCC）是女性生殖道恶性肿瘤之一，约占外阴恶性肿瘤的90%，好发于老年女性［1］。近年来，一些流行病学调查发现这种肿瘤的发生有年轻化趋势，且与人乳头瘤病毒（HPV）感染有关，主要为HPV16、18和33 型，HPV 的E6、E7 基因与宿主的P53 和RB 基因结合，导致宿主基因失活，促进肿瘤细胞增殖［2］。因此，肿瘤免疫微环境影响肿瘤发生与发展。淫羊藿属草本植物，在中医应用中已有数千年历史。淫羊藿苷（icariin，ICA）是淫羊藿提取物中的主要成分，为黄酮类化合物。既往研究发现ICA具有抗炎、抗氧化、保护神经元、促进心肌干细胞分化、预防类固醇相关骨坏死的作用［3-5］。近年来，ICA 在改善免疫功能、抗肿瘤方面的作用备受关注。一些研究发现ICA 可调节T 淋巴细胞、NK 细胞和巨噬细胞等免疫细胞功能，增强机体免疫力，起到局部抗肿瘤免疫调节作用［6-8］。同时发现ICA 通过一些信号通路抑制癌基因表达，起到抗肿瘤作用，如女性的子宫内膜癌、宫颈癌和卵巢癌，但在女性外阴癌中尚未有相关报道［9-11］。

本研究在体外利用细胞系研究ICA 是否对VSCC 增殖有抑制作用，并从有丝分裂灾变的角度探讨ICA 抑制肿瘤生长的可能机制，为后续的体内抗肿瘤免疫调节机制研究奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料 ICA（20 mg，纯度HPLC：98.53%）购自中国科学院成都生物研究所；VSCC 细胞系SW962购自浙江如耀生物科技有限公司；Vimentin 抗体、Chk1（Ser345）抗体、CDC25C 抗体（货号：A19607、AP0578、A12234，ABclonal）；α-tubulin（货号：A01080，Abbkine）；cyclin B1 抗体（货号：12231，CST）；CDK1抗体（货号：13127，SAB）；GAPDH（货号：sc-25778，Santa Cruz）；caspase-3 抗体（货号：ER30804，华安生物科技有限公司）；cleaved caspase-3（货号：ab49822，Abcam）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich）；碘化丙啶（PI，采用PBS 配制成2 mg/ml 母液，4 ℃保存）、DAPI（甲醇溶解，配制成1 mg/ml母液，-20 ℃避光保存）、抗荧光淬灭剂（索莱宝试剂公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT，CAS号：298-93-1，Amersco）；光学显微镜（DM500，Leica）；流式细胞仪（Life Attune，ABI）；FlowJo V10（美国BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SW962 使用含10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/ml） 和链霉素（100 µg/ml）的DMEM 培养基，置于37 ℃，含5%CO2的恒温培养箱中培养。

1.2.2 细胞活性检测 在96孔板中接种SW962细胞（2 000 个/孔），同时在孔板底部放置盖玻片，进行细胞爬片。待细胞贴壁后，分别在培养基中加入终浓度为0、200、400、800 µmol/L的ICA 37 ℃处理12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h。分别于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 和72 h 时 滴 加10 µl MTT（5 mg/ml 溶于PBS）加入各孔中，并在37 ℃孵育持续4 h。除去培养基，将150 µl DMSO 加至各孔，振荡5 min。使用酶标仪在570 nm 处测量吸光度。每个浓度在每个时间点设置3个复孔。

1.2.3 HE 染色 在6 孔板中接种SW962 细胞 （2×105个/孔），同时在孔板底部放置盖玻片，进行细胞爬片。待细胞贴壁后，分别在培养基中加入终浓度为0、200、400、800 µmol/L 的ICA 处理36 h。取出细胞爬片，加入4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS清洗后进行苏木精和伊红染色。95%乙醇脱水烘干后，二甲苯透明，滴加中性树胶进行封片，通过光学显微镜进行观察，OPLENIC系统进行拍摄。

1.2.4 DAPI 染色 SW962 细胞在6 孔板中进行爬片后，分别在培养基中加入终浓度为0、200、400、800 µmol/L 的ICA 处理36 h。弃去培养基，滴加 1 ml 4%多聚甲醛，室温固定20 min。0.3%Triton X-100 孵育10 min 进行细胞破膜，PBS 清洗3 次，每次5 min。采用1 µg/ml DAPI（终浓度）对细胞核染色10 min。使用荧光显微镜采集图像。

1.2.5 免疫荧光 SW962 细胞进行爬片后，分别在培养基中加入终浓度为0、200、400、800 µmol/L的ICA处理36 h。滴加4%多聚甲醛，冰上固定20 min。采用0.3%Triton X-100 孵育10 min 进行细胞破膜，1%BSA 室温下封闭处理30 min。滴加兔抗人 Vimentin 和α-tubulin 抗体（1∶50）在4 ℃的湿室中孵育过夜。再采用羊抗兔IgG-FITC 488 nm 抗体（1∶100）在室温黑暗中孵育1 h。采用1 µg/ml DAPI 对细胞核进行复染，滴加抗荧光淬灭剂进行封片。使用荧光显微镜采集图像。

1.2.6 细胞周期检测 收集0、200、400、800 µmol/L的ICA 处理36 h 的SW962 细胞（5×105个）。加入预冷PBS 洗涤2 次后500 g 离心。滴加300 µl PBS 重悬细胞。在涡轮振荡器下缓慢滴加700 µl无水乙醇（-20 ℃预冷）。4 ℃固定细胞1 h，500 g 离心5 min后，去上清。预冷PBS清洗2次后，加入0.5 ml 染色液（2 mg/ml PI 10 µl，50 mg/ml RNase 1 µl，1×BD buffer 489 µl）室温避光孵育30 min。利用流式细胞仪进行细胞周期检测，结果采用FlowJo V10进行分析。

1.2.7 Western blot 收集0、200、400、800 µmol/L ICA 处理36 h 的SW962 细胞（5×105个）。采用RIPA裂解缓冲液冰上裂解细胞10 min。4 ℃下10 000 g 离心15 min。转移上清，混匀，在样品缓冲液中煮沸。取5 µl 用于BCA 试剂盒进行蛋白浓度检测。蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到PVDF 膜。孵化的膜在室温下采用5%脱脂奶粉封闭1 h，添加兔抗人一抗chk1（Ser345）/cdc25c/cyclin B1/cleaved casepase-3/caspase-3 和内参抗体GAPDH（1∶1 000），在4 ℃下孵育过夜。TBST 缓冲液冲洗膜，羊抗兔IgG-HRP 二抗孵育1 h，TBST 洗涤后，将条带暴露于ECL 发光液中，通过UVP仪进行曝光拍摄。

1.3 统计学分析 本研究的所有数据均以3 次重复的±s表示。所有结果均使用GraphPad Prism 8.0软件处理。两组间比较采用t检验。多组间比较采用单因素方差分析，进行Tukey's 事后检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ICA 对SW962 细胞活性及核形态的影响 不同剂量ICA 作用于SW962 细胞后，相差显微镜下观察细胞形态变化。细胞表层黄色析出物为ICA，在高浓度ICA 作用下未见明显细胞形态变化（图1A）。HE 染色结果显示（图1B），200 µmol/L ICA 作用后，便可观察到SW962 细胞核出现多级分裂，细胞核出现异型，并400、800 µmol/L ICA 作用后 SW962 细胞胞质部位出现明显空泡样变。DAPI 染色结果显示（图1C），细胞在ICA 处理后，出现巨大多核细胞，除主核外还观察到较多微核结构，极个别细胞甚至主核消失。MTT 检测细胞活性结果显示（图1D），ICA作用36 h 后，与0 µmol/L ICA 对照组相比细胞活性显著下降。因此，后续实验采用ICA 处理36 h 后为检测时间点。与HE染色及DAPI染色观察到的结果相同，200、400 和800 µmol/L ICA 作用后，SW962 细胞核均出现多级分裂，细胞核出现异型，800 µmol/L ICA作用后，多核细胞出现概率最多（图1E）。

图1 ICA对SW962细胞形态及活性的影响Fig.1 Effect of ICA on morphology and activity of SW962 cells

2.2 ICA 通过诱导SW962 细胞有丝分裂灾变抑制癌症发展 免疫荧光检测Vimentin和α-tubulin蛋白分布表达情况（图2）。结果显示：ICA 作用下，Vimentin 和α-tubulin 蛋白在分裂核周出现凝聚，且 呈现多极分布。而未经ICA 处理的SW962 细胞 α-tubulin 主要均匀分布于细胞质，Vimentin 则主要以两极分布为主。

图2 免疫荧光检测细胞Vimentin 和α-tubulin 蛋白分布、 表达情况Fig.2 Distribution and expression of cell Vimentin and α- tubulin protein were detected by immunofluorescence

2.3 ICA 调控细胞周期并促进细胞凋亡 流式细胞术检测ICA 处理后SW962 细胞周期变化，通过FlowJo V10 软件进行分析量化（图3A、3B），结果表明ICA 处理后，处于G2/M 期的细胞显著增加，细胞 出现G2/M 期阻滞。Western blot 检测有丝分裂灾变及凋亡相关蛋白表达水平（图3C），结果表明： 200 µmol/L ICA 作用后，有丝分裂相关蛋白Chk1（ser345）、cyclinB1、CDK1及cdc25c表达在12 h时显著 增 加（P＜0.05），在24～48 h 时 逐 渐 减 弱，而cleaved caspase-3 蛋白则在12～48 h 内逐渐增强（P＜0.01，图3D～H）。

图3 ICA对SW960细胞周期及凋亡的调控Fig.3 Regulation of ICA on SW960 cell cycle and apoptosis

3 讨论

有丝分裂灾变是一种消除高等真核生物有丝分裂无功能细胞的策略，由复杂且知之甚少的信号级联驱动。有丝分裂灾变的特征是独特的核改变，出现多核和/或微核。巨大的多核细胞来源于错误分离的未浓缩染色体簇，而微核细胞来源于后期的滞后染色体或染色体片段，这些染色体或染色体片段留在细胞分裂末期形成子核，从而产生除主核之外的微核［12］。从功能上，有丝分裂灾变可以定义为一种内在的肿瘤抑制机制。有丝分裂驱动失败后，细胞增殖水平减弱，最终走向死亡或衰老。因此，诱导有丝分裂灾变可以抑制肿瘤生长［13-14］。本研究首先通过MTT 法检测ICA 能否抑制SW962 细胞生长，结果发现在ICA作用36 h后，细胞活性与对照组相比明显下降。ICA对SW962细胞增殖具有抑制作用。其次，通过HE 染色和DAPI 染色观察SW962 细胞形态和核改变。相差显微镜下观察：不同剂量ICA 作用于SW962 后细胞的形态无明显变化。HE染色结果显示：ICA 处理后，SW962 细胞核出现异型，多级分裂，且随着浓度增加，细胞质中可见明显空泡样变。DAPI 染色结果显示：ICA 处理后，出现巨大多核细胞，除主核外还观察到较多微核结构。提示：ICA 诱导SW962 细胞发生有丝分裂灾变。在有丝分裂进程中需要各种细胞成分的参与，微管就是其一。它由α-tubulin 和β-微管蛋白等亚基组成［15］。有丝分裂开始，微管从细胞两侧的中心体发出，附着在染色体上，牵拉染色体移，构成纺锤丝的一部分。Vimentin 在细胞力学中发挥关键作用，为有丝分裂纺锤体组织提供空间，并调节分裂细胞中肌动蛋白表层的稳定性［16-17］。正常有丝分裂时，Vimentin在两个子细胞间几乎均匀分布。而在有丝分裂灾变中Vimentin 会凝聚在染色体附近，干扰有丝分裂纺锤体，导致异常有丝分裂，有丝分裂灾变［18］。为进一步探讨ICA 作用下SW962 细胞有丝分裂灾变的形成机制，选取α-tubulin 及Vimentin 蛋白进行研究，结果显示：ICA 作用下，Vimentin 和α-tubulin蛋白在分裂核周出现凝聚，且呈多极分布，这一现象与DUARTE 等［18］及IZDEBSKA 等［19］的研究相类似。进一步证实ICA 诱导SW962 细胞发生有丝分裂灾变。

有丝分裂灾变的发生，对SW962 细胞的增殖和凋亡有何影响？通过流式细胞术、Western blot 方法检测ICA 处理后细胞周期及相关蛋白表达变化，结果显示：流式细胞仪检测观察到SW962 细胞在ICA 处理后，G2/M 期被明显阻滞。Western blot 检测Chk1（ser345）、cyclinB1、CDK1 及cdc25c 蛋白在ICA处理12 h 时显著增加，在24～48 h 时逐渐减弱。细胞周期进程中主要是由CDKs、Cyclin、CKI 共同调控，Cyclin-CDK 复合物是调控细胞周期过程的核心元素。其中CyclinB1和CDK1是细胞周期G2/M 检查点的主要调控元件，能介导G2/M 期转换，启动有丝分裂［20-21］。cdc25c 是CDK1/CyclinB1 的主要激活物，通过激活CDK1/CyclinB1 促进细胞从G2期进入M期。检查点效应激酶Chk1 介导时间性细胞周期停滞，在G2/M 转换中起重要作用［22-23］。一旦Chk1被异常激活，受损DNA 未完成修复便进入G2期，提前进入有丝分裂，将诱导细胞发生有丝分裂灾变，G2/M期阻滞也是有丝分裂灾变的一个特征［22，24］。本研究中Chk1（Ser345）在ICA 处理12 h 后表达显著上升。提示在SW962 细胞中受损的DNA 提早进入G2期。与此同时，G2/M 期转换调控的CDK1/cyclinB1 及其激活物cdc25c 蛋白表达增加。细胞提前进行G2/M期转换。但在随后24～48 h 内，细胞的Chk1（Ser 345）、CDK1、cyclinB1 和cdc25c 蛋白水平逐渐降低，结合前面α-tubulin及Vimentin蛋白在分裂核周出现凝聚，并且呈现多极分布的实验结果，提示随着ICA浓度的增加，诱导SW962 细胞发生有丝分裂灾变，细胞停滞在G2/M 期。CHEN 等［25］采用ICA 处理宫颈癌HeLa 和SiHa 细胞12 h 时，细胞周期停滞和凋亡不明显，但处理24 h 后细胞周期停滞和凋亡明显，与在外阴鳞癌SW962细胞中观察的现象一致。XIN等［25］还发现ICA 诱导的活性氧促进人宫颈癌细胞DNA 链断裂和凋亡，研究中发现ICA 诱导VSCC 有丝分裂灾变可能与ICA 诱导癌细胞DNA 断裂有关。进一步加深对ICA 抑制癌细胞增殖潜在机制的认识。ICA 阻滞细胞周期停滞、抑制细胞增殖，在不同的肿瘤细胞中作用点有所不同：前列腺癌PC-3细胞和慢性骨髓性白血病K562 细胞阻滞在G1期；急性骨髓样白血病细胞和伯基特淋巴瘤Raji细胞阻滞在S期；诱导人肺癌细胞A549细胞周期阻滞于S期［26］；ICA 通过抑制CyclinB、cdc2 和cdc25c 的表达将人乳腺癌MDA-MB-231 细胞周期阻滞在G2/M 期，乳腺癌MCF-7 细胞和检测的外阴鳞癌SW962 细胞均阻滞在G2/M期，可能与细胞内环境不同有关［27］。

MATTIELLO 等［28］研究认为Chk1 依赖的有丝分裂灾变，通常导致半胱天冬酶依赖性细胞凋亡的发生。ICA诱导乳腺癌MCF-7细胞中caspase-3蛋白表达增加，促进细胞凋亡，通过线粒体和fas 介导的caspase 依赖通路诱导人肝癌SMMC-7721 细胞凋亡［29-30］。本研究发现ICA 可诱导Chk1 依赖的VSCC发生有丝分裂灾变，为进一步证实在VSCC 中ICA是否也诱导Caspase 依赖性的细胞凋亡，选取caspase-3 进行检测，结果发现：cleaved caspase-3 蛋白在ICA处理后的12～48 h内表达逐渐增强，促进细胞凋亡。说明SW962 细胞发生有丝分裂灾变后细胞向半胱天冬酶依赖性凋亡方向转化，抑制细胞增殖。

T 淋巴细胞是细胞免疫中的主要细胞，T 细胞表面表达Fas 分子，而一些肿瘤细胞表面高表达Fas受体（FasL），当Fas 与FasL 结合将诱导T 细胞凋亡，出现免疫逃逸现象。如上所述，ICA 可诱导人肝癌细胞凋亡，同时降低FasL 表达，使T 细胞的凋亡减少，从另一方面可以看出ICA 在抗VSCC 增殖的同时可能增加了免疫性T 细胞的功能，具有抗肿瘤免疫调节作用［31］。