王 晔，于 淼，张 丞，张婉君，马永平

（保定市第二医院口腔科 河北 保定 071000）

牙源性干细胞包括牙髓干细胞、牙周膜干细胞以及根尖牙乳头干细胞。牙髓干细胞是一种成体干细胞，一般存在于牙髓组织，具有类似于间充质干细胞的生物学特性，可被诱导分化为成牙本质细胞，具有成骨分化能力，所以对牙周组织再生具有重要作用。体内实验证明，将牙髓干细胞分泌的细胞外囊泡植入大鼠无髓根管，促进牙髓再生，在某些刺激因子作用下，牙髓干细胞可发生牙本质再生[1-2]。BMP-2在骨再生的促进和维持中发挥重要作用，而且是已知的骨诱导性生长因子之一[3]，Han等[4]的体外研究证明，BMP-2失活抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞样细胞分化。将含有人重组BMP-2载体注入颅骨缺损的大鼠体内，可有效促进颅骨愈合，且反复给药并不能增强或减弱愈合能力[5]。BMP信号可激活其受体Smad1/5，Smad1/5信号分子可将细胞因子转导信号由细胞质转至细胞核，调控靶基因转录[6]。研究报道，BMP-2/Smad信号通路与成骨分化密切相关，该信号通路激活不仅改善骨质疏松症，而且可促进骨髓间充质干细胞成骨分化[7-8]。但BMP-2是否可激活Smad1/5在牙髓干细胞向成牙本质细胞分化过程中发挥调控作用的研究甚少，因此，本研究以人牙髓干细胞为研究对象，探讨BMP-2对牙髓干细胞成牙本质分化的影响以及对Smad1/5信号通路的影响。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器：①Smad1/5信号通路抑制剂LDN-193189购自美国Selleck公司；②CCK-8细胞活性检测试剂盒购自日本Dojindo公司；③BCA试剂盒购自德国赛默飞世尔科技公司；④碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）试剂盒购自北京索莱宝科技公司；⑤Trizol试剂盒、反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；⑥p-Smad1/5、Smad1/5、BMP-2和GAPDH抗体购自美国Abcam公司；⑦茜素红购自美国Thermo Fisher Scientifie公司；牙本质基质蛋白1(Dentin matrix protein 1,DMP1)和牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP）引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成；⑧可见分光光度计购自上海光学仪器五厂有限公司；⑨酶标仪购自美国Bio-TEK公司；⑩细胞系：人牙髓干细胞(上海研生实业有限公司)。

1.2 细胞培养与分组：将人牙髓干细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每2 d更换一次培养基，待细胞融合度达到90%时，0.25%胰蛋白酶消化、传代。取第3代对数生长期的人牙髓干细胞，DMEM培养基将细胞重悬，接种于24孔板，细胞密度为3×104个/孔，置于培养箱中培养，当细胞密度约为80%时，随机分为对照组、单纯诱导组和抑制剂组。对照组细胞不做任何处理，单纯诱导组细胞用浓度为100 ng/ml的BMP-2诱导液[9]（BMP-2溶于DMEM培养基）培养，抑制剂组细胞先用200 nmol/L的LDN-193189处理24 h后，弃去原有培养液，更换为BMP-2诱导液。培养14 d后，用于以下实验。

1.3 CCK-8法检测人牙髓干细胞活性：收集各组细胞，制成细胞密度为1×107个/毫升的细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μl，培养箱中继续培养5 h，每孔加入CCK-8工作液10 μl，轻轻混匀后37℃孵育30 min，设置酶标仪波长为450 nm，测定吸光度OD值，OD值越大说明活细胞活性越强。实验重复5次。

1.4 qRT-PCR法检测DMP1和DSPP mRNA相对表达量：收集各组细胞，4℃下Trizol试剂提取细胞中总RNA，利用逆转录试剂盒，将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，以GAPDH为内参，进行扩增，反应程序设定为：95℃预变性4 min，95℃变性5 s，56℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40个循环，采用2-△△CT计算DMP-1和DSPP的相对表达量。实验重复5次。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 ALP活性检测：收集各组细胞，PBS清洗后，加入全细胞裂解液，冰上裂解10 min，4℃ 1 000 r/min离心5 min，吸取上清液，缓冲液、显色液依次加入到上清液中，可见分光光度计检测510 nm波长处的吸光度A值。按照说明书，绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品浓度，样品测定浓度与标准蛋白浓度值的比值为ALP活性。实验重复5次。

1.6 茜素红染色观察矿化结节情况：取各组细胞，PBS清洗3次，每孔加入40 g/L的多聚甲醛溶液1 ml室温固定30 min，PBS清洗3次，每孔加入40 mmol/L的茜素红染液1 ml，室温避光染色20 min，双蒸水清洗4次，倒置显微镜下观察矿化结节情况并拍照。实验重复5次。

1.7 蛋白印迹法检测BMP-2、p-Smad1/5蛋白相对表达量：收集各组细胞，PBS清洗3次，加入100 μl RIPA裂解液，冰上静置30 min，4℃ 1 2000 r/min离心10 min，离心半径为10 cm，收集上清，BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液后，100℃煮沸10 min，使蛋白变性稳定。80 V电泳20 min使蛋白至分离胶处，120 V电泳2 h，湿转2 h，将蛋白转至PVDF膜上，TBST洗膜3次，室温封闭1 h，BMP-2、p-Smad1/5、Smad1/5、GAPDH一抗（1:1 000）4℃孵育过夜，二抗（1:5 000）室温孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL法显色，Image J计算蛋白条带灰度值，BMP-2、p-Smad1/5、Smad1/5蛋白条带灰度值与GAPDH蛋白条带灰度值的比值为目的蛋白表达量。实验重复5次。

1.8 统计学分析：采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计量资料均以（±s）描述，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞活性检测结果：细胞活性组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，单纯诱导组细胞活性增强（P＜0.05）；与单纯诱导组比较，抑制剂组细胞活性降低（P＜0.05）。见表2。

表2 三组细胞活性比较 （±s，n=5）

表2 三组细胞活性比较 （±s，n=5）

注：*表示与对照组比较，P＜0.05；#表示与单纯诱导组比较，P＜0.05。

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2.2 qRT-PCR检测结果：DSPP、DMP-1 mRNA相对表达量组间比较，差异有统计学意义；与对照组比较，单纯诱导组、抑制剂组的DSPP、DMP-1 mRNA相对表达量升高；与单纯诱导组比较，抑制剂组DSPP、DMP-1 mRNA相对表达量降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 三组细胞中DSPP、DMP-1 mRNA相对表达量比较（±s，n=5）

表3 三组细胞中DSPP、DMP-1 mRNA相对表达量比较（±s，n=5）

注：*表示与对照组比较，P＜0.05；#表示与单纯诱导组比较，P＜0.05。

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2.3 ALP活性检测结果：ALP活性组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，单纯诱导组、抑制剂组ALP活性升高（P＜0.05）；与单纯诱导组比较，抑制剂组ALP活性降低（P＜0.05）。见表4。

表4 三组细胞中ALP活性比较 （±s，n=5）

表4 三组细胞中ALP活性比较 （±s，n=5）

注：*表示与对照组比较，P＜0.05；#表示与单纯诱导组比较，P＜0.05。

2.4 茜素红染色结果：与对照组比较，单纯诱导组矿化结节明显增多；与单纯诱导组比较，抑制剂组矿化结节明显减少。见图1。

图1 茜素红染色（×40）

2.5 BMP-2、p-Smad1/5蛋白相对表达量检测结果：BMP-2、p-Smad1/5蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，单纯诱导组、抑制剂组BMP-2、p-Smad1/5蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与单纯诱导组比较，抑制剂组BMP-2、p-Smad1/5蛋白相对表达量降低（P＜0.05）。见图2、表5。

表5 三组细胞中BMP-2、p-Smad1/5蛋白相对表达量比较（±s，n=5）

表5 三组细胞中BMP-2、p-Smad1/5蛋白相对表达量比较（±s，n=5）

注：*表示与对照组比较，P＜0.05；#表示与单纯诱导组比较，P＜0.05。

图2 细胞中BMP-2、p-Smad1/5蛋白表达

3 讨论

人牙髓干细胞存在于牙髓组织中，具有高度增殖、多向分化潜能以及无免疫排斥等特点，且来源广、获取方便，因此，被视为牙髓再生的理想种子细胞。正常状况下，人牙髓干细胞处于静息状态，在某些刺激因素作用下，可分化为成牙本质细胞、成骨细胞、脂肪细胞以及软骨细胞[10]。牙本质是组成牙齿的硬组织部分，其中含有牙本质小管，管中存在神经纤维和液体成分，外界刺激可通过牙本质小管传至牙髓。当出现牙齿磨损或龋齿时，牙髓干细胞可分化为成牙本质细胞，成牙本质细胞快速分泌大量基质，产生修复性牙本质，封闭牙本质小管，阻断细菌入侵，避免牙髓发生炎症反应造成不可逆性损伤。

BMP是一类高度保守的具有分泌作用的功能性蛋白，目前发现的BMP有20多种亚型，除BMP-1外，其余亚型属于TGF-β家族。BMP活化后以二聚体的形式存在，通过作用于受体及信号转导途径触发细胞发育。Zhong等[11]研究发现，长链非编码RNA H19可上调人牙髓干细胞中BMP-2表达，促进牙髓干细胞向成牙本质细胞转化。在人牙髓干细胞和小鼠骨髓基质细胞成骨分化过程中，BMP-2可增强ALP活性、细胞外基质矿化和成骨基因表达[12]。体外研究表明，早期BMP-2和血管内皮生长因子培养人根尖乳头干细胞，可促进其骨/牙源性分化[13]。成牙本质细胞在早期分化和矿化阶段，需经历细胞增殖和细胞外基质合成，在此阶段特异性表达ALP，高分化的成牙本质细胞中ALP显著高于未分化细胞，因此ALP可作为早期成牙本质细胞分化的标志物。胶原Ⅰ是牙本质细胞外基质蛋白中最丰富的蛋白，在成牙本质细胞分化、牙本质形成和矿化过程中具有重要作用，而研究发现，100 ng/ml BMP-2诱导液可促进胶原Ⅰ的表达和分泌[14]，从而控制成牙本质细胞分化以及牙本质形成。已有研究表明，将BMP-2溶于培养基中，制成浓度为100 ng/ml的培养液，培养14 d后ALP活性增强。本研究通过BMP-2诱导液培养人牙髓干细胞，10 d后同样检测到ALP活性增强，此实验结果提示牙髓干细胞发生成牙本质细胞转化。

DSPP和DMP-1是评判成牙本质细胞分化的关键指标，DSPP是牙本质中含量最为丰富的非胶原基质，在牙本质矿化中起重要作用，但DSPP合成后很快被酶切成牙本质涎蛋白和牙本质磷蛋白。既往研究表明，Bbx通过调节DSPP控制新生鼠牙根形成，DSPP转基因小鼠可部分修复DSPP基因缺失小鼠的牙本质缺陷[15-16]。DMP-1是成牙本质细胞早期分化时特异性表达的磷酸性蛋白酶，通常与DSPP联合判断成牙本质细胞分化情况。Ma等[17]研究发现，DMP-1可增强β-磷酸三钙种植体在犬上颌窦底，可增强骨再生和骨整合。本研究中，100 ng/ml BMP-2诱导液培养后DSPP和DMP-1 mRNA相对表达量升高，茜素红染色显示矿化结节明显，提示牙髓干细胞发生成牙本质细胞转化并发生矿化。

经典的BMP/Smads信号通路在多种疾病的骨代谢和骨分化中的作用已被广泛报道，Yuan等[18]报道强直性脊柱炎中BMP/Smads信号通路的激活被抑制后，可降低成纤维细胞的成骨转化。细胞外钙通过放大BMP-2对Smad信号的影响促进骨髓间充质干细胞的骨形成[19]。胰岛素样生长因子1通过激活BMP-2/Smad1/5信号通路促进犬上颌窦黏膜干细胞成骨分化[20]。诱导多能干细胞实现牙齿再生是一种新的干细胞来源，而研究发现，200 nmol/L Smad1/5信号通路抑制剂LDN-193189处理多能干细胞，可抑制其成釉分化效应[21]。本研究采用Smad1/5抑制剂LDN-193189预处理后，BMP-2诱导液培养人牙髓干细胞，蛋白印迹法检测BMP-2和Smad1/5蛋白表达情况，结果显示，LDN-193189可降低BMP-2诱导液培养的人牙髓干细胞中BMP-2和Smad1/5蛋白表达，提示BMP-2/Smad1/5信号通路参与调控人牙髓干细胞牙本质分化。

综上所述，BMP-2可促进人牙髓干细胞成牙本质分化，其可能是通过调节Smad1/5信号通路发挥调控作用，但本研究存在一定不足之处，BMP-2剂量选择以及不同处理时间对牙髓干细胞成牙本质的影响需要确定。另外，BMP-2如何调节Smad1/5信号通路以及Smad1/5信号通路激活后在促进成牙本质分化中具体发挥怎样的作用需要进一步探讨。