■张展赫 马 轩 王梦雅，2 李 茹 邵 凯 吴东霖 徐 明*

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）

反刍动物和单胃动物对营养物质的利用率有很大的不同，这是由于在长久进化过程中采食不同饲料造成的，反刍动物的消化生理比单胃动物复杂得多，营养物质都要首先经瘤胃微生物发酵，而单胃动物都是通过消化液将营养物质分解为小分子营养物质后被吸收。由于单胃动物体内没有分泌淀粉酶的腺体，淀粉胃内不能被降解，会直接进入小肠，小肠中含有多种消化液（如胰液等）。反刍动物摄入的淀粉有15%～25%不经过瘤胃消化，直接进入小肠[1]，但是反刍动物小肠对淀粉的消化率有限，仅能消化40%～62%的过瘤胃淀粉[2]。因此，仅将淀粉消化位点转移到小肠并不能提高淀粉的利用率，而一些支链氨基酸（亮氨酸）可以促进胰腺的发育和胰酶的合成，进而可以提高小肠对淀粉的利用[3]。

胰腺具有内分泌和外分泌双重功能，外分泌功能受到多种因素的影响，如动物年龄[4]、日粮[5-6]等。Swason 等[5]发现真胃灌注酪蛋白可以提高胰腺α-淀粉酶的分泌量。现有研究表明，胰腺消化酶分泌不足会限制小肠中淀粉的消化[2，8]，因此可以提高胰腺消化酶的分泌来提升对淀粉的利用率。前期试验表明，十二指肠灌注亮氨酸可以增加胰腺酶的分泌[9-10]，在对奶山羊体外胰腺组织培育的研究中也发现，亮氨酸可以提升α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的分泌[11]。相反，在单胃动物，亮氨酸能够抑制胰腺α-淀粉酶mRNA的表达，降低了α-淀粉酶的分泌[12-13]。目前关于亮氨酸对不同动物体外胰腺组织消化酶分泌是否存在种间差异尚无报道。

健康养殖是现代养殖业实现可持续发展的前提，而科学的营养策略是保障动物健康的根本手段[14]，基于此，本试验旨在通过体外组织培养的方法，研究亮氨酸对牛、羊、猪、鸡胰腺消化酶的分泌是否存在种间差异，为提高小肠淀粉利用率，减少饲料资源浪费提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验一

亮氨酸浓度对体外胰腺组织消化酶分泌的影响规律。

1.1.1 试验设计

试验采用单因素试验设计，亮氨酸浓度设置为0、2.62、5.24 mg/mL 和10.48 mg/mL，胰腺组织分别来自西门塔尔牛、大白猪、白羽鸡以及小尾寒羊，每种动物选取5头（只）屠宰。

1.1.2 试验方法

选用健康、体况良好的牛5头，屠宰后，立即取出胰腺，用4 ℃的生理盐水冲洗，并置于4 ℃盐水中送去实验室进行组织剥离，切成2 mm×2 mm（约0.1 g）的小块，用滤纸吸干水分后称重，使用Swanson等[15]描述的方法孵育胰腺组织。将组织块放入含有0、2.62、5.24 mg/mL 和10.48 mg/mL 亮氨酸的Krebs Ringer bicarbonate buffer（KRB）溶液中进行组织块培养，每个处理5个重复，并在39 ℃恒温水浴摇床中以90次/min的振荡频率分别培养1 h后，将培养板置于冰上，采集培养液和胰腺组织用于测定组织释放酶活和组织内酶活（α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶）。将所有培养液的pH调至7.4。羊、猪、鸡的处理与牛一样，胰腺组织分开培养。

1.2 试验二

亮氨酸对牛、羊、猪、鸡体外胰腺组织消化酶分泌的交互影响。

1.2.1 试验设计

试验采用双因素交互试验设计，亮氨酸浓度为0、5.24 mg/mL，所用胰腺组织与试验一相同。

1.2.2 试验方法

试验二动物与培养方法同试验一，取牛、羊、猪、鸡胰腺组织一起培养。亮氨酸浓度梯度设置为0、5.24 mg/mL，培养时间为1 h。

1.3 测定指标与方法

胰腺组织和培养液样品主要用于分析α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，其试剂盒均购自南京奥青生物技术有限公司。一个酶活性单位定义为39 ℃下每分钟释放1 μmol产物。

组织释放（IU/g）=KRB培养液（mL）×酶活性（IU/mL）/组织重量（g）

1.4 统计分析

通过SAS 9.2的GLM程序分析消化酶活性数据，试验一使用单因素方差分析（ANOVA）分析培养时间内亮氨酸对胰腺消化酶参数的影响；试验二使用Duncan’s法对组均值之间的显著性进行多重比较及交互作用分析。P＜0.05时，表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 亮氨酸浓度对体外胰腺组织消化酶分泌的影响

2.1.1 亮氨酸浓度对牛体外胰腺组织和组织释放中消化酶分泌的影响规律

由表1 可知，亮氨酸对胰腺组织中α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的影响呈线性增加（P＜0.05），对脂肪酶的活性没有显著影响（P＞0.05）；亮氨酸对胰腺组织释放中α-淀粉酶活性的影响呈线性增加（P＜0.05），线性降低了脂肪酶的活性（P＜0.05），对胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的影响呈二次变化（P＜0.05）。

2.1.2 亮氨酸浓度对羊体外胰腺组织和组织释放中消化酶活性的影响规律

由表2 可知，亮氨酸对胰腺组织中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性的影响呈线性增加（P＜0.05）；亮氨酸对组织释放中α-淀粉酶和胰蛋白酶活性的影响呈线性增加（P＜0.05），对脂肪酶和糜蛋白酶活性的影响呈二次曲线变化（P＜0.05）。

表2 亮氨酸浓度对羊体外胰腺组织和组织释放中消化酶活性的影响规律（IU/g）

2.1.3 亮氨酸浓度对猪体外胰腺组织和组织释放中消化酶分泌的影响规律

由表3 可知，亮氨酸对胰腺组织中脂肪酶活性的影响呈线性增加（P＜0.05），对α-淀粉酶和糜蛋白酶活性的影响呈二次变化（P＜0.05），但是不影响胰蛋白酶的活性（P＞0.05）；亮氨酸对胰腺组织中释放的α-淀粉酶、脂肪酶和糜蛋白酶活性的影响呈线性增加（P＜0.05），对胰蛋白酶活性的影响呈二次变化（P＜0.05）。

表3 亮氨酸浓度对猪体外胰腺组织和组织释放中消化酶活性的影响规律（IU/g）

2.1.4 亮氨酸浓度对鸡体外胰腺组织和组织释放中消化酶分泌的影响规律

由表4 可知，亮氨酸对胰腺组织中α-淀粉酶、脂肪酶活性的影响呈线性增加（P＜0.05），对胰蛋白酶活性的影响呈二次变化（P＜0.05），不影响糜蛋白酶的活性（P＞0.05）；亮氨酸对胰腺组织释放中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的影响呈线性增加（P＜0.05）。

表4 亮氨酸浓度对鸡体外胰腺组织和组织释放中消化酶活性的影响规律（IU/g）

结合试验一与先前的研究[16]表明，促进胰腺消化酶分泌的最佳浓度为5.24 mg/mL，因此将它们作为试验二的孵育条件。

2.2 亮氨酸对牛、羊、猪、鸡体外胰腺组织消化酶分泌的交互影响

由表5 可知，不同动物种类对胰腺组织中α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的分泌有显著影响（P＜0.05），亮氨酸对α-淀粉酶和脂肪酶的分泌有显著影响（P＜0.05），动物种类和亮氨酸浓度对脂肪酶和糜蛋白酶的活性有交互作用（P＜0.05）；动物种类对培养液中释放的α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性有显著影响（P＜0.05），亮氨酸对α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶有显著影响（P＜0.05），动物种类和亮氨酸浓度对α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性具有交互作用（P＜0.05）。

表5 亮氨酸对牛、羊、猪、鸡体外胰腺组织培养液中消化酶活性的交互作用(IU/g)

3 讨论

通过体外组织培养法对胰腺组织外分泌功能进行评价，这种方法可以排除其他因素的作用，从而可以更好的帮助我们研究营养物质对胰腺分泌功能的影响[15]。与单胃动物相比，反刍动物的淀粉消化率较低的一个关键限制因素是胰腺淀粉酶分泌不足[1，5，8，17]。现有研究已经证明十二指肠蛋白对胰腺α-淀粉酶基因表达和分泌的影响在反刍动物和单胃动物之间是不同的，单胃动物降低[18]，但是反刍动物的基因表达和分泌量是升高的[6，19-20]，目前还没有研究比较过亮氨酸对不同动物胰腺组织外分泌功能的影响，因此，可以推测亮氨酸对反刍动物胰腺α-淀粉酶的影响与非反刍动物不一样。

本试验结果表明亮氨酸可以提高牛、羊、猪、鸡胰腺组织消化酶的活性。在刘凯[21]的研究中发现，亮氨酸能够提高奶山羊体外胰腺组织α-淀粉酶的分泌，在亮氨酸浓度为2.62 mg/mL 和5.24 mg/mL 时，显著提高了α-淀粉酶的活性，而10.48 mg/mL 对α-淀粉酶的活性没有影响。十二指肠灌注亮氨酸可以提高山羊α-淀粉酶的活性[22]，对奶牛α-淀粉酶的合成速率呈先升高后降低的趋势[20]，但也有研究表明亮氨酸不影响犊牛α-淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的活性[23-24]。有研究证明，亮氨酸可以通过调节mTOR信号通路进而影响胰腺消化酶的活性[25]，也可以通过改变基因表达调节其活性。给猪注射或口服亮氨酸其胰腺、肝脏和骨骼等组织中的蛋白质合成会增加[26-27]。上述试验结果互不相同，而与本试验结果也有不同，造成这种的原因可能是由于体内和体外的影响因素各有不同，以及不同试验动物之间生理状态等不同。

本研究的试验结果表明，鸡胰腺组织中的α-淀粉酶低于牛、羊、猪。但猪、鸡小肠淀粉消化率较牛和羊更高[2-3]。通过前人的研究发现，牛[28]、羊[29]的胰腺消化酶分泌量显著低于猪[30]和鸡[31]。因此，单胃动物与反刍动物小肠淀粉消化的差异主要不在胰腺组织层面，而是在胰腺器官、体液环境等的差异，这方面需要进一步深入研究。

目前，亮氨酸对反刍动物与非反刍动物胰腺消化酶分泌是否存在种间差异方面尚未见报道。本研究结果发现亮氨酸对不同动物胰腺消化酶的分泌具有交互作用。现有研究已经证实十二指肠蛋白对单胃动物[25]与反刍动物[7，19-20]胰腺α-淀粉酶的作用是存在差异的，这与本试验结果相符。根据前人的研究结果，亮氨酸对mTOR、ISR等信号通路的调节机制不同导致了不同动物之间胰腺消化酶存在种间差异[11，25]，具体机制有待进一步研究。

4 结论

本研究表明，亮氨酸能够线性提升牛、羊、猪、鸡体外胰腺组织消化酶的分泌和释放，且亮氨酸对不同动物体外胰腺组织消化酶的分泌存在种间差异。