莫房德，姚妮，公方强，施丽，莫丽芬，牛向丽

随着冷冻复苏技术的不断发展，配子(精子和卵子)和胚胎的冷冻保存及复苏成为人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)一项重要的衍生技术。胚胎的冷冻保存和复苏技术减少了促排卵次数和胚胎的浪费，减少了患者卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)的发生，从而增加胚胎移植的机会[1-2]。卵母细胞冷冻保存在生殖医学及生育力储存领域是一项值得探讨的潜力技术。女性随着年龄的增加，生育力急剧降低、自然流产率上升，对卵母细胞冷冻保存的需求已经显著增加[3-4]，卵母细胞冷冻保存不仅可以为接受放疗、化疗或由于其他病理原因而不能或者延缓生育的女性提供妊娠的机会，为患者储存多余的卵母细胞，还可以用于卵子捐赠计划，给失去卵巢功能的患者提供妊娠的机会[5-6]。

液氮应用于生殖医学领域，是配子及胚胎的主要冷冻贮存媒介。精子、卵母细胞以及胚胎需要一直在液氮罐中冷冻贮存，但是液氮罐一旦发生泄漏，将导致罐内温度迅速上升，从而打破细胞的玻璃化状态，对胚胎造成不可逆的伤害。谢敬田等[7]研究发现，随着时间的推移，液氮储存罐内的液氮液面下降，该区域的温场特性会更差，温度会更高，不利于样品的长期保存。因此，加强监测液氮罐内液氮挥发量，保证液氮罐内胚胎的安全，是胚胎冷冻保存的重要环节。目前尚缺少液氮罐在失真空后样本保存效果的研究，本研究试图通过模拟液氮罐发生泄漏后，液氮罐内温度对精子、卵母细胞以及胚胎影响的规律，进而评估液氮罐发生泄漏后对配子和胚胎的影响，为生物样本保存提供实验依据。

1 材料与研究方法

1.1 主要试剂与仪器

试剂：玻璃化冷冻液(KITAZATO日本)，玻璃化解冻液(KITAZATO日本)，缓冲输卵管液(Quinn's美国)，SPS(Quinn's美国)，卵裂输卵管液(Quinn's 美国)，精子冷冻保护剂(SAGE美国)。 仪器：IVF工作站(ESCO新加坡)，倒置显微镜(Nikon日本)，CO2培养箱(Thermo美国)，精子分析系统(CASA 西班牙)，液氮罐(MVE美国)。

1.2 研究方法与分组

1.2.1 液氮罐分组 A罐为部分失真空液氮罐，使用过程液氮罐表面有水珠、盖子周围有结冰表示液氮罐已经破损，为部分失真空。B罐为完全失真空液氮罐，表面进行了打孔处理。C罐为完好液氮罐。

1.2.2 动物实验及卵母细胞的获取 参考张超凡等[8]的实验方法，将收集到的卵丘卵母细胞复合体用于体外受精试验，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养至卵裂期，用于冷冻试验，将去颗粒细胞后的卵母细胞用于冷冻试验。

1.2.3 精子采集 取10只10周龄雄鼠，采用颈椎脱臼法处死，无菌条件下取出附睾尾，于1023+10%SPS中冲洗3次，用眼科镊轻轻挤出精子，收集精子悬液，用梯度离心处理精液，取其沉淀，用受精液上游精子，用CASA精子分析系统计数精子活力及浓度。

1.2.4 精子、卵母细胞、胚胎冷冻 精子冷冻：上游处理后精子分80份，在精子悬浮液中逐渐加入等体积的精子冷冻保护剂，边加边混匀，用微量加样器吸取30 μL吸入2 mL的冷冻管(CORNING430659美国)，先存于4℃冰箱10 min,再-20℃冷冻10 min，再在液氮面上5 min后投入液氮保存，冻存至少24 h后从液氮中取出，立即将冷冻管置于37℃恒温水浴箱中复苏5 min。用CASA精子分析系统计数复苏后活动精子数目、精子活动率。卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻解冻：本次实验卵母细胞与胚胎玻璃化冷冻参考本中心的冷冻解冻方法[9-10]。

1.2.5 剩余液氮量与温度变化测定 用凯丰电子称(型号A17-LCD)对三组液氮罐(型号XC 47/11)称重，每隔1 h检测液氮罐重量，同时用衡星数字温度计(型号LCD-06058)记录温度变化。连续监测72 h，记录三组液氮罐重量及温度变化。

1.2.6 各类样本存活率分析 根据以上液氮挥发以及温度变化情况，把用冷冻小鼠的精子、卵母细胞、胚胎放于完全失真空的液氮罐(B)，根据完全失真空的液氮罐的温度变化的情况来确定解冻时机，在温度上升到-180℃时解冻第一组精子、卵母细胞以及胚胎，之后每隔1 h解冻一组，共分4组解冻，观察各个时间段精子、卵子、胚胎的存活状态。

1.2.7 精子冷冻复苏效果的评价标准 采用精子冷冻复苏率作为精子冷冻复苏效果，公式如下：精子冷冻复苏率=(复苏后活动率/冷冻前活动率)×100%。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组液氮罐液氮挥发量的变化情况

72 h内，A罐、B罐、C罐相比较，B罐液氮挥发更快，A罐液氮挥发8.25 kg，B罐液氮挥发31.9 kg，C罐液氮挥发1.15 kg；26 h内，A罐、B罐、C罐相比较，B罐液氮挥发的更快，A罐液氮挥发4.2 kg，B罐液氮挥发31.7 kg，C罐液氮挥发0.4 kg。详见下页图1。

图1 各组液氮罐液氮挥发量的变化情况

2.2 各组液氮罐内温度的变化情况

72 h内，A罐、B罐、C罐相比较，B罐温度上升到25℃，A罐和C罐温度无变化，均为-198.8℃；26 h内，A罐、B罐、B罐比较，B罐温度上升到-72℃，而A罐和C罐温度仍然是-198.8℃。详见下页图2。

图2 各组液氮罐内温度的变化情况

2.3 各组精子、卵母细胞、胚胎解冻后存活率的变化情况

各组精子解冻后，复苏率差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。第1、2、3组卵母细胞解冻后，存活率差异无统计学意义(P>0.05)，而第4组卵母细胞冷冻复苏率显著低于第1、2、3组(P<0.05)，卵母细胞存活率仅为61.11%，见表2。第1、2、3组卵裂期胚胎解冻后，存活率差异无统计学意义(P>0.05)，而第4组卵裂期胚胎冷冻复苏率显著低于第1、2、3组(P<0.05)，卵裂期胚胎存活率仅为64%，见表3。

表1 完全失真空液氮罐解冻各组精子复苏率的比较

表2 完全失真空液氮罐解冻各组卵母细胞存活比较

表3 完全失真空液氮罐解冻各组卵裂期胚胎存活比较

表4 液氮罐与液氮挥发量、温度变化关系

3 讨论

随着辅助生殖的发展，越来越多的卵母细胞以及胚胎进行玻璃化冷冻并储存在液氮罐里。卵母细胞具有表面积与体积比小、含水量高和存在减数分裂纺锤体等特点，故成熟卵母细胞是最难成功冷冻的细胞之一。卵母细胞冷冻的影响因素包括：冷冻保护剂对卵母细胞造成渗透损伤和冷冻过程中胞内冰晶形成造成的机械损伤[11]。以上因素造成的卵母细胞微丝、微管、中间丝等细胞骨架的损伤，透明带硬化破裂，皮质颗粒外排，细胞膜、线粒体等超微结构破坏，纺锤体损伤、染色体畸变等，都会对卵母细胞的存活率、受精率、妊娠率以及子代安全性造成直接影响。

卵母细胞玻璃化冷冻能减少对细胞的物理伤害，但是细胞存活率的高低不是单一因素造成的，是每一个环节共同作用的结果。发生玻璃化转变的卵母细胞以及胚胎，一直保在液氮中，当需要恢复其活性时，必须复温到环境温度，但在复温过程中却极其容易发生重结晶现象[12]。有研究表明，玻璃化后胚胎的存活能力取决于细胞脱水的程度和复苏时升温的速率,在复苏过程中使用超快速升温获得小鼠卵母细胞和胚胎的高冷冻存活率[13]。本研究发现，液氮罐失真空后复温过程对精子损伤影响较小，对卵母细胞和卵裂期胚胎影响较大，造成了第4组较多的卵母细胞和卵裂期胚胎退化(见下页图3、图4)。这可能是因为，液氮罐失真空导致的复温，升温速率是缓慢的，卵母细胞和胚胎未能快速通过-120℃到-35℃的危险阶段，导致重结晶对卵母细胞和胚胎的损伤而影响后续的发育能力[14-15],甚至造成细胞死亡。因此，在使用液氮罐的过程中要经常检查，可以用肉眼观测，也可以用手触摸外壳，若发现蒸发量突然异常增多或外壳金属表面突然结霜，说明液氮存在失真空可能，应立即停止使用[16]。

图3 完全失真空液氮罐解冻卵母细胞第4组(-63℃)

图4 完全失真空液氮罐解冻卵裂期胚胎第4组(-63℃)

本实验通过比较A罐、B罐、C罐之间的液氮挥发量，推测出液氮罐损伤状况及其严重程度，从上页表4观察可知，当液氮罐24 h内挥发0.4～0.5 kg，属于正常挥发量，当液氮罐24 h内挥发4～5 kg，属于预警值，说明液氮罐已经部分失真空，必须立即停止使用。当液氮罐24 h内挥发30 kg，说明液氮罐已经完全失真空，此时液氮罐内温度已经上升至-158℃，罐内卵母细胞及胚胎可能已经发生了不可逆性损伤。本研究不足之处在于，完全失真空液氮罐内温度的变化确定解冻时机，不确定液氮罐内温度从-196℃上升至-180℃时配子(精子和卵子)和胚胎是否已经造成损伤。同时，对于各组解冻存活的卵母细胞和胚胎，仅从形态学上观察其存活状态，难以确定是否已经造成卵母细胞和胚胎的微丝、微管、中间丝等细胞骨架的损伤以及细胞膜、线粒体等超微结构破坏。有关卵母细胞及胚胎在液氮罐内温度的临界值及在该温度储存多长时间才会对卵母细胞和胚胎造成损伤，有待进一步研究。

综上，B罐26 h时液氮挥发了31.7 kg，这是挥发的最大值，说明B罐内液氮已经完全挥发，而此时B罐内的温度已经上升到-72℃。另外，本研究的复苏实验是根据温度来复苏卵母细胞以及卵裂期胚胎并计算其的存活率，复苏实验的第4组温度为-63℃与B罐内的-72℃为相近温度，而此刻的温度会导致卵母细胞以及卵裂期胚胎不再是玻璃化状态，从而导致卵母细胞以及卵裂期胚胎造成损伤。故本实验认为液氮罐完全失真空后26 h内温度迅速上升，对精子损伤影响较小，对卵母细胞与胚胎会造成不可逆的损伤。