米尔古丽·艾麦特， 不艾吉尔·艾力， 王成凤， 曼古努尔·玉山， 仲 婷， 景 燕， 木克代斯·米尔地洋， 李红燕

(新疆维吾尔自治区人民医院， 新疆 乌鲁木齐 830001)

癫痫属于中枢神经系统中仅次于脑血管病的第二大常见病[1]。妊娠可能增加癫痫发作频率，更可能造成胎儿早产、先天畸形、出生体重降低、发育迟滞、认知损伤，甚至极易诱发儿童癫痫等严重疾患[2]。临床数据[2]显示，孕期癫痫发作与抗癫痫药物都可能会造成子代神经功能发育迟缓，甚至影响到子代成年后的认知功能，尤其是对语言能力的形成影响深远。因此，通过动物模型更加深入了解该疾病的发病机制有助于更精确治疗策略的实施。然而，孕期癫痫发作引起子代成年后认知功能和海马结构损伤的实验研究相对较少，组织学结构改变及其发生机制仍有待进一步深入阐明。miR-146a在癫痫成人和儿童都出现表达增高，且抑制miR-146a能够降低癫痫的易感性，减少发作频率[3]。但miR-146a对孕期癫痫的作用未见相关报道。因此，本研究以电点燃癫痫发作孕鼠为研究对象，从组织学水平观察miR-146a对电点燃癫痫发作孕鼠子代的大脑发育和认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1实验动物：18只240～270g SPF级雌性SD大鼠，购自新疆医科大学动物实验中心，许可证号SYXK(新)2018-0001。饲养环境：温度(22±1)℃、相对湿度(60±5)%，12h光照/黑暗周期，自由进食和饮水，饲料为孕鼠专用。

1.1.2主要试剂：miR-146a抑制剂(西安擎科生物有限公司)；尼氏染色试剂盒(北京索莱宝生物科技公司)；高尔基染色试剂盒(美国Thermo公司)。

1.1.3仪器：癫痫完全点燃电刺激仪器、生物信号采集与分析系统(成都泰盟软件有限公司)；Morris水迷宫设备(江苏赛昂斯公司，SA201)；荧光定量PCR仪(美国Bio-rad公司，Applied Biosystems 7500)；生物显微镜(日本Olympus公司，BX53)；激光扫描共聚焦显微镜(美国Thermo公司，CX7 Pro)。

1.2方 法

1.2.1分组及干预：18只大鼠随机数字法分为对照组、模型组和miR-146a抑制剂组，每组6只。对照组：大鼠只植入电极，不进行电刺激；模型组：大鼠进行电刺激癫痫模型构建；对照组与模型组分别静脉注射PBS溶液，每周2次至大鼠分娩。miR-146a抑制剂组：大鼠癫痫模型构建成功后开始注射miR-146a抑制剂(剂量：2mg/kg)，该抑制剂是西安擎科生物有限公司合成，每周2次至大鼠分娩。

1.2.2电极植入：将大鼠麻醉后固定在立体定向仪上，顶部皮肤消毒，切开头皮，完全暴露颅骨。于大鼠头骨钻孔，电极穿透颅骨，插入脑皮质。参照Paxinos大鼠脑立体定向解剖图谱[4]，确定大鼠杏仁基底核坐标为：-2.8mm，±4.8mm，-8.5mm，于杏仁基底处分别植入刺激电极、记录电极并固定。

1.2.3电流刺激点燃癫痫：将大鼠头部电极与刺激器和脑电记录仪连接，通电刺激，诱导癫痫。参数：刺激频率60Hz，波宽1.0ms，串长10s，恒定单向电流刺激，每天1次。当动物连续7d出现Racine评分4～5级，标志癫痫点燃成功。将雌鼠与健康成年雄鼠合笼，阴道涂片监测雌鼠受精，精子阳性者定为怀孕第0天(G0)。对照组不进行电刺激，维持模型组与miR-146a抑制剂组点燃状态，隔日开展一次电刺激，直至G20天，记录孕鼠癫痫等级。等待孕鼠自然分娩。最终，各组孕鼠在21～23d自然分娩，对照组雌鼠4只分娩，共39只，模型组雌鼠3只分娩，共25只，miR-146a抑制剂组雌鼠4只分娩，共34只。将各组雌鼠分娩的所有子代分配至对应三组。测量仔鼠出生后2、4、7、14d体重、体长，观察开眼，出牙，睁眼时间，记录出生后第7、14d翻正反射与抓握反应所用时间。

1.2.4Racine行为学分级法：0级=无任何反应；1级=面部阵挛，包括节律性咀嚼、眨眼、立须、竖尾等；2级=节律性点头运动为主的肌肉抽搐；3级=单侧前肢阵挛、抽搐；4级=双侧前肢阵挛、抽搐且后肢站立；5级=背曲、后肢强直加失衡跌倒。

1.2.5脑电图(electroencephalogram,EEG)描测：将大鼠头部电极与刺激器和脑电记录仪连接，采用频率60Hz，波宽1.0ms，串长1s的单向方波恒流参数刺激。电流强度由50μA开始刺激，每次间隔5min递增20μA，直至EEG可见≥3s的棘波放电，记录此时的电流强度。在相同电流强度下，通过软件描记皮层EEG。

1.2.6RT-PCR检测仔鼠脑组织中miR-146a含量：取出生后1d仔鼠脑组织，每组5只，液氮中磨碎，加入Trizon Reagent震荡混匀。离心取上清，加入氯仿，剧烈振荡。离心取上层无色水相至一个新的离心管中，加入无水乙醇混匀，提取分离得到总RNA并逆转录为cDNA。取cDNA进行qPCR扩增反应，反应体系为：5μL 2×All-in-One QPCR Mix，0.2μL 2μM正向引物，0.2μL 2μM反向引物，2μL cDNA，补充ddH2O至10μL体系。扩增反应条件：95℃ 10min预变性，95℃ 15s 45循环变性，60℃ 1min退火。定量分析结果以Ct值表示，用2-△△Ct方法计算目的基因相对表达量。见表1。

表1 引物序列

1.2.7水迷宫检测仔鼠认知功能：取出生后84d仔鼠，正式实验前开展自由游泳适应。定位航行测试共5d，用于评估大鼠学习能力。每天分上、下午两个时间段，每段训练4次。各个象限依次作为入水点，面向池壁轻轻放入水中。记录大鼠从入水到爬上逃生平台时间，即逃避潜伏期。空间探索实验：评估大鼠的空间记忆能力。定位航行实验完毕次日，撤除平台，选择第I象限为入水点，记录大鼠在120s内为搜寻平台而在平台象限的游泳时间和穿越平台象限的次数。

1.2.8尼氏染色检测神经元损伤：取出生后85d仔鼠全脑组织，固定于10%福尔马林溶液，常规脱水包埋。将脑组织切成厚5μm切片，常规脱蜡至水。切片置于焦油紫染色液中，56℃环境中浸染1h。蒸馏水冲洗切片，使用Nissol Differentiation试剂分化1～3min，显微镜下观察，当背景接近无色停止。梯度乙醇脱水，二甲苯透化，中性树胶封固，显微镜下观察并拍照。

1.2.9高尔基染色观察树突棘状态：取出生后85d仔鼠全脑组织，浸泡于溶液1与溶液2的混合液(溶液1、2以及溶液3、4、5均是高尔基染色试剂盒中试剂)中，冷藏14d。转移脑组织至溶液3中冷藏48h，异戊烷冷冻包埋，切成10μm厚切片，载玻片贴片，滴加溶液4与溶液5混合液反应30min。蒸馏水冲洗切片，梯度乙醇脱水，二甲苯透化，中性树胶封固。激光共聚焦显微镜下捕获海马区树突棘图像，统计树突棘密度。

2 结 果

2.1各组孕鼠分娩的仔鼠观察：仔鼠体重与体长方面，模型组仔鼠都明显低于对照组和miR-146a抑制剂组(P<0.001)。仔鼠翻正反射方面，仔鼠出生后的第7d，模型组仔鼠翻正反射所用时间明显高于对照组和miR-146a抑制剂组(P<0.001)；在第14d，各组仔数翻正反射所用时间比较快，没有差异。仔鼠抓握反应方面，仔鼠出生后的第7d与第14d，模型组仔鼠抓握反应低于对照组(P<0.01)，但miR-146a抑制剂组明显高于模型组(P<0.001)。见图1与表2。

图1 各组仔鼠出生后体重与体长变化注：与对照组相比，**P<0.01，***P<0.001；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

表2 各组仔鼠出生后的情况变化

2.2各组仔鼠mRNA基因表达比较：与对照组相比，模型组miR-146a基因表达量升高P<0.01)。与模型组相比，miR-146a抑制剂组miR-146a基因表达量降低(P<0.01)。见表3。

表3 各组仔鼠miR-146a基因表达量

2.3各组仔鼠Morris水迷宫实验结果比较：与对照组对比，模型组仔鼠潜伏期增加(P<0.05)；对照组与miR-146a抑制剂组差异均无统计学意义(P>0.05)；第3d起，与模型组相比，miR-146a抑制剂组潜伏期明显减少(P<0.01)。如表5所示，在穿越平台区域次数方面，与对照组相比，模型组仔鼠明显减少(P<0.05)；在平台象限游泳时间方面，与对照组相比，模型组仔鼠也明显缩短(P<0.001)；与模型组相比，miR-146a抑制剂组穿越平台次数与平台象限游泳时间明显增加(P<0.05)。见表4、表5。

表4 水迷宫实验逃避潜伏期(s)

表5 水迷宫空间探索实验

2.4尼氏染色观察各组仔鼠脑组织神经元：在仔鼠颞叶皮层和海马下托复合体中，与对照组相比，模型组和miR-146a抑制剂组中尼氏体数量减少；与模型组相比，miR-146a抑制剂组中数量增加。见图2。

图2 仔鼠颞叶皮层和海马下托复合体尼氏染色结果(n=5，×200倍)

2.5高尔基染色观察各组仔鼠海马区树突棘：与对照组相比，模型组树突棘长度和数量明显下降(P<0.01)；与模型组相比，miR-146a抑制剂组中树突棘长度和数量增加(P<0.05)。见图3、图4。

图3 仔鼠海马区树突棘高尔基染色结果(×100倍，×1000倍)

图4 仔鼠海马区树突棘量化统计(n=5)注：与对照组相比，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01

3 讨 论

本研究选择了杏仁核慢性电点燃癫痫模型，模拟了临床常见的颞叶癫痫发作，且避免了化学点燃物质对孕鼠胎儿的影响。本实验模型设计上，成年雌鼠受孕前先构建癫痫完全点燃模型，相比于受精后再点燃癫痫模型，癫痫发生后受精更符合临床实际情况。由于胎鼠神经发育损伤依赖于外界持续的刺激，因此，本研究孕鼠癫痫点燃会持续至分娩。仔鼠出生时，各组体重与体长没有明显差异，但仔鼠生长过程中，模型组仔鼠体重和体长都明显低于对照组。仔鼠在翻正反射、抓握方面也存在差异，与对照组相比，模型组仔鼠翻身反射时间增加，且抓握时间减少。Rajabzadeh等[5]人研究报道中也有显示癫痫孕鼠生育能力受损，且子代健康状况较差，主要表现为体重较轻、体长较短、大脑发育较正常组迟缓。水迷宫测试中，与对照组相比，模型组仔鼠逃避潜伏期明显增加，这也反映了仔鼠受大脑发育迟缓的影响，认知功能明显受损。因此，本研究认为母体癫痫反复发作是造成胎儿各项机能发育迟缓的重要原因。

miR-146a是哺乳动物体内一种常见的内源性非编码RNA，参与Toll样受体和细胞因子受体信号调节。与正常人相比，局灶性癫痫患者其血清中miR-146a含量升高，对于频发全身性癫痫患者，其血清中miR-146a含量更高。本研究显示，与对照组相比，模型组仔鼠脑组织中miR-146a含量明显升高。此外，其他中枢神经系统退行性疾病中也有显示，miR-146a表达升高不仅会通过Toll样受体诱导炎症反映，甚至引起神经元凋亡。因此，miR-146a在中枢神经系统中可能是诱导神经凋亡的重要因子。神经凋亡也是造成大脑发育迟缓，损伤认知功能的主要因素。本研究采用了尼氏染色是评估神经元状态，在神经元细胞代谢功能旺盛的神经元中尼氏体特别丰富，而当神经元细胞受到损伤或者过度疲劳时，尼氏体出现解体，减少甚至消失[6]。本研究结果显示，模型组尼氏染色细胞减少，反映了中枢神经系统发育受损，与此同时，神经元树突棘萎缩会造成突触形成受损。由于突触是树突棘之间电信号传递的生理基础，而信息传递则是记忆储存提取的前提[7]。Dong[8]研究中指出，母胎接触神经毒性物质会通过胎盘传递给子代，通过下调Rac1/PAK/LIMK1/cofilin信号通路，影响突触结构和树突棘发育，损害海马突触可塑性，导致子代认知能力的降低。因此，miR-146a表达增加诱发的神经凋亡与树突棘萎缩共同反映了仔鼠中枢神经系统发育损伤，与Morris水迷宫中仔鼠逃避潜伏期增加相关。然而，对于miR-146a抑制剂组，母体怀孕期间静脉注射miR-146a抑制剂，通过胎盘传递造成仔鼠脑组织中miR-146a表达降低，尼氏小体细胞数量增加，树突棘密度与长度增加，提示降低miR-146a表达能够逆转母体癫痫的影响，促进仔鼠中枢神经系统发育，提高仔鼠远期认知能力。

综上所示，母体孕期癫痫完全点燃造成仔鼠脑组织中miR-146a表达增加，miR-146a是影响仔鼠体格生长和中枢神经系统发育的危险因素，降低miR-146a表达能够明显促进仔鼠体格生长，促进中枢神经系统发育，提高树突棘密度与长度，改善仔鼠远期的认知功能。