甘志强， 张 丹， 陈 印， 廖 飞

(四川省达州市中西医结合医院麻醉科， 四川 达州 635000)

骨关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种最普遍的退行性关节疾病，最常发生在膝关节，主要表现为软骨退化、滑膜炎症、韧带钙化、软骨下骨增厚。轻度骨关节炎的会出现关节僵硬、疼痛和水肿等症状；严重者会导致骨关节功能障碍，无法正常行动[1,2]。因此，对恢复软骨损伤的研究在骨关节炎治疗过程中存在巨大作用。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是细胞内的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，该家族还包括细胞外信号调节激酶(ERK)、C-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38[3]。有研究表明MAPK/ERK信号通路能够调节细胞增殖、分化、凋亡等过程，ERK磷酸化被抑制能够减轻滑膜炎症和软骨损伤[4,5]。依托咪酯(Etomidate，ET)是一种短效的静脉麻醉剂，有较强的抗应激和抗炎作用。据了解依托咪酯能够保护软骨细胞免受氧化应激，减轻细胞衰老[6]。基于上述发现，推测依托咪酯在OA治疗中有潜在作用，但其具体作用和机制还未知。因此本研究建立骨关节炎大鼠，探讨依托咪酯对其软骨损伤的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1材料:SPF级SD雄性大鼠72只，6周龄体重180～200g，购于广东省医学实验动物中心，许可证号：SYXK(粤)2022-0002。饲养条件：温度24～26℃，湿度60%，本研究经动物伦理委员会批准。

1.2药品及试剂:依托咪酯，购自于江苏恩华药业股份有限公司，国药准字H32022992；双氯芬酸钠注射液购自于辅仁药业集团有限公司，国药准字H20068165；苏木素和伊红染液均购自于北京索莱宝科技有限公司；TNF-α、IL-1β、COMP ELISA试剂盒均购自于武汉武汉赛培生物科技有限公司；p-ERK1/2、ERK1/2、MMP-13一抗购自于英国Abcam生物公司；山羊抗大鼠IgG二抗购自于艾美捷科技有限公司有限公司；双足平衡测痛仪购自于安徽耀坤生物科技有限公司；电子压痛仪购自于上海软隆科技发展有限公司；热板测痛仪购自于上海玉研科学仪器有限公司；凝胶成像仪购自于Miulab公司，型号GIS-500。

1.3骨关节炎大鼠模型制备:参照文献[7]采用MIA注射法建立骨关节炎大鼠模型，将部分实验大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(40mg/kg)，然后在大鼠后肢右侧膝关节腔内注射碘乙酸(1mg/kg)，正常饲养2周后，发现大鼠骨关节肿胀并疼痛，影响行走，表示建模成功。假手术组大鼠注射等量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

1.4动物分组和给药:造模成功后，将所有大鼠分为假手术组、模型组、阳性组、ET低、中、高剂量组，平均每组12只。阳性组腹腔注射给予15mg/kg的双氯芬酸钠，ET低、中、高处理组分别腹腔注射给予1.5mg/kg、3mg/kg、6mg/kg三个剂量，假手术组和模型组大鼠均以相同方式注射等体积的纯净水，每天1次，持续14d。

1.5评估各组大鼠关节水肿大小和承重不对称性:给药结束后，用游标卡尺分别测量各个实验组大鼠左右后肢膝骨关节处的宽度，并将左右膝关节宽度之差记为水肿的大小。然后再将各组大鼠的左右后肢放在双足平衡测痛仪的玻璃室当中，并保持大鼠直立且安静，保证准确检测体重在两后肢分配情况，对两后肢均进行3次测量，取平均值。

1.6检测各组大鼠压痛阈值和热痛阈值:利用电子压痛仪检测大鼠的压痛阈值，将大鼠用电子压痛仪的固定简固定，用压痛仪的扁形头对大鼠右后足施压，当大鼠开始挣扎或发出叫声时所产生的压力值即为压痛阈值。随后采用热板测痛仪检测大鼠的热痛阈值，将大鼠放置在热平板上，从大鼠开始接触热平板至出现抬起或舔足行为的时间即为热痛阈值，每只大鼠均测量3次，并取平均值。

1.7HE染色观察各组大鼠软骨病理损伤情况，进行Mankin评分:将各组大鼠麻醉后，分别在尾静脉进行采血，血液样本静置10min后，4℃ 3000×g离心10min，取上清保存于-80℃。大鼠全部麻醉取血后，打开大鼠右后肢膝关节腔，取软骨组织部分(n=6)放置于-80℃保存，部分(n=6)放置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋并切片。然后，分别用二甲苯和不同浓度梯度的乙醇对石蜡切片脱蜡。脱蜡完成后清洗样本，用苏木精染色10min，清洗后放入伊红染液复染5min。再由高到低放入不同浓度梯度的乙醇，二甲苯透明。最后，中性树脂固定封片。光学显微镜下观察软骨组织的病理变化并拍照。按Mankin评分标准对软骨损伤程度进行评分：0分：正常；1分：表面不规则；2分：血管翳形成；3分：裂缝进入过渡层；4分：裂缝进入辐射层；5分：裂缝进入钙化层；6分：结构完全被破坏。

1.8TUNEL检测OA大鼠软骨细胞凋亡:将1.7中的软骨石蜡切片用0.2%Triton X-100孵育5min，PBS清洗，再按照TUNEL试剂盒说明加入工作液，37℃避光孵育1h，PBS清洗3次，用DAPI复染10min，PBS清洗后封片，荧光显微镜观察并计算细胞凋亡率。

1.9ELISA试剂盒检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP水平:将1.7中保存的血清置于冰上解冻，随后按照ELISA试剂盒说明书相应的操作步骤检测IL-1β、TNF-α、COMP在大鼠血清中的表达水平。

1.10蛋白免疫印迹法检测各组大鼠软骨组织中MMP-13、ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达情况:将1.7中保存的软骨组织进行研磨，并加入蛋白裂解液制备蛋白样品，进行 SDS-PAGE 凝胶电泳。然后在冰上进行转膜实验，转膜电压为100V，时间1h，结束以后拆除转膜装置取出 PVDF 膜，TBST 洗膜，用BSA封闭液室温振荡孵育2h，洗膜，加入用脱脂奶粉配置的一抗稀释液(MMP-13、 p-ERK1/2、 ERK1/2抗体稀释倍数 1∶2000)，4℃孵育过夜，TBST洗膜，加入羊抗鼠IgG二抗稀释液(稀释倍数1∶1000)，室温振荡孵育2h，洗膜后用ECL避光充分显色，然后用凝胶成像仪观察蛋白表达情况。以GAPDH为内参蛋白，分析蛋白表达量。

2 结 果

2.1ET对OA大鼠关节水肿和承重不对称的影响:与假手术组相比，模型组OA大鼠关节水肿和承重不对称性均升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，阳性组、ET低、中、高剂量组大鼠关节水肿和承重不对称性均降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，且ET高剂量组与阳性组无显著差异(P>0.05)，详见表1。

表1 ET对OA大鼠关节水肿大小和承重不对称性的影响

2.2ET对OA大鼠压痛阈值和热痛阈值的影响:与假手术组相比，模型组中OA大鼠右后肢的压痛阈值和热痛阈值均降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，阳性组、ET低、中、高剂量组右后肢的压痛阈值和热痛阈值均升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，且ET高剂量组与阳性组无显著差异(P>0.05)，详见表2。

表2 ET对OA大鼠压痛阈值和热痛阈值的影响

2.3ET对OA大鼠软骨组织形态和Mankin评分的影响:HE染色结果显示，假手术组的软骨组织结构正常，细胞排列整齐；与假手术组相比，模型组软骨组织缺损，细胞数量减少，软骨层变薄，Mankin评分升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，阳性组和ET低、中、高剂量组软骨损伤被逐渐修复，细胞数量增多，排列均匀，软骨层变厚，Mankin评分降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，且ET高剂量组与阳性组无显著差异(P>0.05)，详见图1和表3。

图1 ET对OA大鼠软骨组织形态的影响(HE染色，×200)

表3 ET对OA大鼠软骨组织Mankin评分情况

2.4ET对OA大鼠软骨组织细胞凋亡的影响:与假手术组相比，模型组OA大鼠软骨细胞凋亡率升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，阳性组、ET低、中、高剂量组软骨细胞凋亡率降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，且ET高剂量组与阳性组无显著差异(P>0.05)，详见下图2和表4。

表4 各组OA大鼠软骨细胞凋亡率

图2 ET对OA大鼠软骨细胞凋亡率的影响(×200)

2.5ET对OA大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β及COMP水平的影响:与假手术组相比，模型组OA大鼠血清中TNF-α、IL-1β、COMP含量升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，阳性组、ET低、中、高剂量组血清中TNF-α、IL-1β、COMP含量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，且ET高剂量组与阳性组无显著差异(P>0.05)，详见表5。

表5 ET对大鼠血清中TNF-α IL-1β COMP水平的影响

2.6ET对OA大鼠软骨组织中MMP-13、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的影响:与假手术组相比，模型组OA大鼠软骨组织中MMP-13、p-ERK1/2蛋白表达及p-ERK1/2/ERK1/2比例升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，阳性组、ET低、中、高剂量组软骨组织中MMP-13、p-ERK1/2蛋白表达及p-ERK1/2/ERK1/2比例降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，且ET高剂量组与阳性组无显著差异(P>0.05)，详见图3和表6。

表6 ET对OA大鼠软骨组织中MMP-13 ERK1/2 p-ERK1/2蛋白的影响

图3 各组大鼠软骨组织中MMP-13、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的影响A：假手术组；B：模型组；C：阳性组；D：ET低剂量组；E：ET中剂量组；F：ET高剂量组

3 讨 论

OA是老年人中常见的一种关节病，主要是由外力造成的创伤或者是与年龄相关的软骨损伤引起的。OA的主要特征是关节器官衰竭，对关节内和其周围的组织产生影响，包括软骨退化、滑膜炎症等[8]。这些损伤引起的慢性疼痛、关节水肿等症状严重影响患者的正常生活质量。本研究建立了OA大鼠模型，通过检测大鼠膝关节水肿情况、承重不对称性以及大鼠痛阈值发现，模型组大鼠较假手术组比，膝关节水肿严重，两后肢承重明显不对称，且右后肢痛阈值明显降低；HE染色也表现出明显的软骨组织缺损，软骨层变薄，细胞数量减少且分布紊乱，Mankin评分升高，说明OA大鼠模型建立成功。ET是一种静脉麻醉剂，对多种疾病存在药理作用，有研究指出ET能够抑制IL-1β诱导的细胞氧化应激和衰老，对软骨细胞产生保护作用[6,9]。本研究实验结果发现，与模型组相比，阳性组和ET低、中、高剂量组中大鼠的关节水肿情况和承重不对称性明显有所减缓，且痛阈值也明显升高；HE染色显示软骨组织损伤修复，软骨层变厚，细胞数量增加且排列有序，Mankin评分降低，软骨细胞凋亡率降低。揭示了ET能够减轻OA大鼠关节水肿、疼痛以及软骨组织病理形态的损伤。

MAPK是丝裂原活化蛋白激酶，是调节多种细胞活动的主要信号通路，而ERK是MAPK家族的一种细胞外信号调节激酶。目前已知的MAPK的级联反应有4种，其中MAPK/ERK信号通路参与细胞增殖和分化[5]。据了解，MAPKs的抑制剂通过恢复OA中受损的自噬对机体产生保护作用，ERK被激活后也能够介导OA在内等多种疾病的增殖，例如ERK的磷酸化程度的降低能够抑制MAPK信号通路，缓解类风湿关节炎带来的软骨损伤[10]。促炎细胞因子IL-1β是OA中最重要的损伤因子之一，能诱导炎症介质和MMP的释放。其中MMP13已被证明是是软骨病理性破坏的关键酶，是OA发展过程重要的角色[11]。COMP常表达于健康软骨中，是诊断OA的重要指标，在软骨出现损伤时被释放至血清中，其在血清中的水平可预测OA的发展进程[12]。本研究结果显示，模型组OA大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β及COMP的水平升高，软骨组织中MMP-13、p-ERK1/2蛋白表达及p-ERK1/2/ERK1/2比例升高；阳性组和ET低、中、高剂量处理后血清中促炎因子TNF-α、IL-1β及COMP的水平明显降低，MMP-13、p-ERK1/2蛋白表达及p-ERK1/2/ERK1/2比例显著降低。揭示了ET能够抑制炎症反应，减轻软骨组织损伤，并且抑制ERK1/2的磷酸化活化。

综上所述，ET能够通过减轻OA大鼠的软骨组织损伤，减轻骨关节疼痛和肿胀等症状，其作用机制可能与抑制MAPK/ERK信号通路的活化有关。本研究为治疗OA提供了新的思路和药剂，但有研究显示ET不仅可以作为脓毒症的诱导剂，其高剂量使用也可以增加其他心血管疾病发生的风险，还会引起呼吸系统和中枢神经系统的不良反应[13]。因此，ET在OA及其他疾病上的作用剂量范围和不良因素还需在临床试验之前进一步研究和测试。