叶静文，赵欣欣，王宝金，刘立燕，逯彦越，邬智伟

(1.郑州大学第三附属医院 妇科，河南 郑州 450000；2.河南省卵巢癌恶性肿瘤国际联合实验室，河南 郑州 450000)

宫颈癌是女性生殖系统中最常见的肿瘤之一[1]。2018年全球有57万例宫颈癌新确诊病例，其中有31万例病死[2]。早期筛查和疫苗接种能提高宫颈癌的诊断率和治疗率[3-4]。但基于宫颈癌恶性侵入性特性，晚期宫颈癌患者5 a生存率低于30%[5]。Micro(mi) RNA是1个高度保守的非编码RNA家族，参与癌症的发生进展[6]。miRNAs在癌组织中的异常表达和在体液中显著的稳定性使其成为有价值的肿瘤诊断、治疗和预后评估标志物[7-8]。例如，miR-G-10可以通过与GRSF1蛋白结合激活AKT/NF-κB信号通路，从而促进宫颈癌细胞的转移和侵袭[9]。miR-96表达上调与宫颈癌的临床特征密切相关[10]。然而，未有关于miR-3193在癌症中的研究报道，miR-3193与宫颈癌的相关性尚不清楚。以往的研究主要集中在miRNA表达水平对生物学功能的影响，很少有研究者探索miRNA的分子修饰现象。有研究表明，大多数RNA分子，在正常生命过程中受到化学分子修饰[11]。最近有研究表明，甲基化修饰存在于成熟的miRNA中，甲基化修饰miRNA可能是早期癌症的诊断标志[12]。

本研究基于The Cancer Genome Atlas (TCGA)的数百份样本，用生物信息学分析揭示了miR-3193表达、临床特征、DNA甲基化与患者预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1 TCGATCGA作为生物信息学挖掘平台(https://portal.gdc.cancer.gov/)，包含了常见肿瘤的基因表达数据、DNA甲基化和突变数据等多种类型的数据[13]。从TCGA中下载宫颈癌患者的相关数据进行分析和处理。最终纳入191例宫颈癌患者进行生物信息学分析。患者的详细临床信息，如年龄、组织学分级、TNM分期和甲基化状态见表1。

表1 宫颈癌患者详细临床信息

1.2 GO and KEGG富集分析DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)为在线生物信息学数据整合分析工具，可以方便地为用户提供基因或蛋白的数百个最具显著富集生物功能注释信息[14]。此外，Kobas database 6 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)为常用的网络工具，用于注释细胞信号通路[15]。上传差异表达基因，用于在DAVID中进行GO功能分析，在Kobas中进行KEGG通路富集分析(P<0.05)。

1.3 CMap分析The connectivity map database (CMap)(https://portals.broadinstitute.org/cmap/)是生物信息学领域已知的一个基于化学试剂处理后的基因表达谱的数据库[16]。将差异表达基因上传CMap数据库寻找可能用于治疗宫颈癌的药物(P<0.001， enrichment <-0.9)。

1.4 统计学方法使用R软件(3.6.1版)进行数据分析和处理。通过单向ANOV A或t检验来阐明miR-3193表达与其他临床病理因素的相关性。通过绘制Kaplan-Meier生存曲线和受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，预测miR-3193的预后价值。曲线下面积(area under curve，AUC)值为0.5～1.0，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。通过Cox回归分析miR-3193的上调与宫颈癌预后的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-3193表达与临床病理特征的关系利用宫颈癌TCGA-RNA测序数据，探索miR-3193在不同临床阶段的表达水平。miR-3193在Ⅳ期表达高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期miR-3193水平比较，差异无统计学意义(P=0.690、0.560、0.350)(图1A)。病理-T(原发肿瘤大小和局部浸润程度)级别较高时miR-3193表达增加，但T1与T2之间的表达差异无统计学意义(P=0.660)(图1B)。miR-3193表达随组织学、病理-N(淋巴结转移)和病理- M(远处转移)分级增高而增高，但差异无统计学意义(P=0.160)(图1C～1E)。

A为临床分期；B为病理-T分级；C为病理-淋巴结转移；D为病理-远处转移；E为组织学分级。

2.2 miR-3193对宫颈癌患者生存结局的预测价值根据miR-3193的表达情况，将TCGA宫颈癌患者分为低miR-3193表达组和高miR-3193表达组。绘制Kaplan-Meier生存曲线，结果显示高miR-3193表达组患者的总生存时间更短(图2A)。Cox回归法绘制ROC曲线，验证其对宫颈癌预后的价值(图2B)，3、5 a曲线下面积分别为0.675、0.764，说明miR-3193上调对不良预后具有较高的诊断价值。

2.3 miR-3193在宫颈癌中的独立预后价值单因素Cox回归分析，miR-3193高表达、临床晚期、淋巴结转移、远处转移是宫颈癌患者预后的危险因素。见图2C。为了排除混杂因素，进一步多因素Cox回归分析表明，miR-3193高表达是宫颈癌的独立预后危险因素。见图2D。

2.4 miR-3193与甲基化修饰的关系利用TCGA甲基化数据分析了miR-3193甲基化在宫颈癌病理和预后中的生物学价值。miR-3193有2个(cg00494337和cg09923107)甲基化位点。见图3A。 Pearson相关性分析结果显示，miR-3193的表达与其2个甲基化位点的甲基化呈负相关(图3B、3D和3E)。miR-3193的甲基化水平与宫颈癌临床分级和肿瘤大小密切相关(图4A和4B)，与淋巴结转移和远处转移无关(图4D和4C)。在miR-3193的甲基化与组织学分级之间的相关性中，miR-3193的甲基化在组织学分级中呈上升趋势，但这种上升差异无统计学意义(P=0.024)(图4E)。采用Kaplan -Meier方法评价2种甲基化对预后的影响,发现高甲基化水平的cg00494337与预后相关(P=0.015)(图3C)，cg09923107甲基化水平与预后无相关性(P=0.515)(图3F)。

A为临床分期；B为病理-T分级；C为病理-远处转移；D为病理-淋巴结转移；E为组织学分级。

2.5 GO富集分析及KEGG通路富集分析结合GO和KEGG分析，取得差异表达基因相关的生物过程和细胞信号通路的全面视图。GO术语包括 3类：生物过程、细胞成分和分子功能(见表2)。KEGG分析结果显示，差异表达基因在多种细胞信号通路中显著富集(见表3)。

表2 差异基因的GO分析

表3 差异基因的KEGG分析

2.6 CMap数据库筛选宫颈癌候选治疗药物通过CMap数据库筛选出关联度最大的4种小分子化合物：阿霉素、喜树碱、GW-8510和阿扎胞苷。在PubChem平台上搜索了化合物的化学结构信息。见图5。

A为阿霉素；B为喜树碱；C为GW-8510；D为阿扎胞苷。

3 讨论

miRNAs具有稳定性、组织特异性且易获取，可作为肿瘤的早期诊断标志物[17]。本研究首次对miR-3193的表达进行了全面系统的分析，试图探讨其在宫颈癌病理过程中的潜在作用。首先评估miR-3193在宫颈癌中的表达及预后意义。结果显示miR-3193表达及预后与宫颈癌临床分级及肿瘤大小密切相关，miR-3193是预后不良的独立危险因素，推测miR-3193可能作为癌基因促进肿瘤生长，导致患者预后不良。虽然无直接证据支持miR-3193可以促进肿瘤生长，但许多宫颈癌相关的miRNAs与细胞增殖侵袭密切相关，如miR-93[18]、miR-4262[19]、miR-181a[20]和miR-494[21]。

有研究表明miRNA的甲基化修饰可以作为早期癌症的诊断标志物。Konno等[12]在早期胰腺癌患者的血清中检测到甲基化的miR-17-5p，而在健康者的血清中，甲基化的miR-17-5p不存在或仅低水平存在。这启发探究miR-3193在宫颈癌中的甲基化意义。Pearson相关分析结果表明，miR-3193的表达水平可能受到甲基化修饰的负调控。miR-3193低甲基化与晚期恶性特征密切相关，表明miR-3193表达与miR-3193甲基化之间的负相关。宫颈癌患者的预后与甲基化位点cg00494337相关。这提示miR-3193的甲基化修饰可能是宫颈癌的一个潜在的生物标志物。

GO富集分析显示，侵袭能力增强[22-24]、上皮-间质转化[25]、迁移[26]和细胞周期紊乱[27]都是影响肿瘤细胞恶性增殖的重要因素。KEGG通路分析显示，Notch信号通路、TGF-β信号通路、癌症中的MicroRNAs和PI3K-AKT信号通路和HPV感染等与宫颈癌密切相关。Notch信号通路促进宫颈癌细胞的增殖[28]。MiR-200a通过调控HIFα/VEGF通路增强宫颈癌细胞增殖能力[29]。盆腔淋巴结转移与TGF-β信号通路在宫颈癌中的调控密切相关[30]。PI3K-AKT通路的激活增加了癌细胞对顺铂的耐药性[31]。持续感染高危HPV感染是宫颈癌发生的最重要的原因[32]。前面探讨了miR-3193的表达及预后与宫颈癌临床密切相关，对于接下来进一步研究miR-3193调控宫颈癌的相关机制，GO和KEGG分析结果给予研究者相关启发。

为了改善宫颈癌患者的生存和预后，通过CMap分析筛选了4种小分子药物(阿霉素、喜树碱、GW-8510和阿扎胞苷)，认为其可能抑制宫颈癌的发展。阿霉素是一种广谱抗肿瘤药物，已被广泛用于治疗恶性肿瘤，如白血病、恶性淋巴瘤和乳腺癌[33]，在裸鼠乳腺癌模型中注射阿霉素，小鼠肿瘤生长明显受到抑制[34]。有研究发现通过培养内生真菌提取出的喜树碱对宫颈癌细胞(HeLa)抑制能力呈浓度依赖性[35]。虽然无直接证据表明GW-8510和阿扎胞苷对宫颈癌的治疗效果，但它们在其他癌症中被广泛提及[36]。CMap分析结果为宫颈癌的治疗提供了新的选择。

综上所述，本研究探讨了miR-3193在宫颈癌中的致癌作用及其机制。miR-3193的上调和低甲基化均提示宫颈癌患者预后不良。miR-3193可能参与多种信号通路，可能成为宫颈癌诊断和个体化治疗的有价值的靶点。