张瀚林， 余洁英， 田恩伟,2,3

(1.南方医科大学中医药学院， 广东 广州 510515 2.广东省中药制剂重点实验室， 广东 广州 510515 3.广东省中药制剂技术工程实验室， 广东 广州 510515)

重症肌无力(Myasthenia Gravis,MG)是一种当神经肌肉接头进行乙酰胆碱的传递时出现障碍而产生的自身免疫性疾病[1]。正常情况下，骨骼肌神经肌肉接头通过神经递质乙酰胆碱介导完成兴奋的传递，而当机体免疫系统功能出现异常，影响到神经肌接头的正常结构和功能时，则会导致MG的发生[2]。目前，MG在西医临床上的治疗主要以胆碱酯酶抑制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂等药物或手术治疗。其中仍存在一些不足，如胆碱酯酶抑制剂虽能修复神经突触间传递不良的情形，但长期大剂量的使用会降低药效，且引起大量的不良反应；免疫抑制剂虽能达到小剂量、好疗效的效果，但仅仅能够治标，人体自身的免疫缺陷难以得到改善，且会有一定的不良反应，而外科胸腺切除术，虽能缓解大多数患者的病情，但一方面手术自身存在风险，同时重症肌无力有较大异质性，一些患者不能贸然切除胸腺[3]。中医在辨证重症肌无力时，着力其症状表现，认为病位在脾，病性为脾气虚损，故治疗重在补中益气健脾[4]。以邓铁涛教授为代表的岭南医家治疗重症肌无力时，常黄芪与五指毛桃成对药使用，如邓老弟子刘小斌教授治疗MG以黄芪60g，五指毛桃60g为两味主药[5]；邓中光教授在治疗MG，68次开方时据统计常用的频次居前的中药依次为黄芪、升麻、柴胡、五指毛桃等[6]。可见五指毛桃治疗重在肌无力具有丰富的临床实践经验，但是通过查阅文献发现对于治疗 MG的研究仅局限于临床研究和个案报道，缺乏机制的研究和探讨。五指毛桃为桑科榕属植物粗叶榕Ficus hirta Vahl.的干燥根，多分布在我国东南部至西南部、亚洲南部至东南部[7]。其性平味甘，化学成分丰富，有补脾益气、止咳平喘之效，在岭南地区有广泛的临床使用，又名南芪，以补气而不燥得名。网络药理学是利用公共数据库和文献，结合高通量组学技术和生物信息学技术，筛选出了药物的靶点信息，结合相关疾病的靶点信息，通过构建网络模型进行其治疗机制的探索。其能有效推动对于药物作用机制的了解[8]。本文结合网络药理学与分子对接技术，借助数据库获得五指毛桃治疗重症肌无力的关键成分与靶点，并为五指毛桃之后在临床应用方面的深入研究提供科学指导。

1 材料与方法

1.1数据库与软件:中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、PubChem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、Genecard数据库(https://www.genecards.org/)、David数据库(https://david.ncifcrf.gov/)、KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/)、STRING数据库(https://string-db.org/)、Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)、Cystoscape 3.9.0、GO数据库(http://geneontology.org/)、OMIM(https://omim.org/)、微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)、SwissADME数据库(http://www.swissadme.ch/)、Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/) 、PDB数据库。

1.2五指毛桃主要化学成分的获取:通过文献检索五指毛桃的化学成分，并结合中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP、SwissADME数据库中收录的化学成分。按以下方式进行筛选：①通过文献数据库可以搜索得到的已有明确药理活性的化合物；②具有明确结构的化合物。③口服吸收利用度(oralbioavailability，OB)≥ 30%，药物相似性(drug-likeness，DL)≥ 0.18进行筛选。

1.3五指毛桃活性成分作用靶点的预测与转换:将筛选出的化学成分通过中药系统药理数据库TCMSP进行预测，TCMSP未收录或命名存在差异的化合物通过PubChem数据库下载SDF文件，通过Swiss Target Prediction进行预测，将得到的靶点蛋白质名字在Uniprot中进行匹配，将其转换为Gene Symbol，以便为后续筛选做准备。

1.4五指毛桃治疗重症肌无力潜在作用靶点及注释:将“重症肌无力(Myasthenia Gravis)”作为关键词输入Genecard数据库、OMIM数据库检索相关的人类基因，将得到的结果整合后得到相关疾病的靶点信息，再将获得的靶点信息与五指毛桃活性成分的潜在靶点相比对，取交集并去重，最后得到五指毛桃治疗重症肌无力的靶点及蛋白信息。

1.5五指毛桃治疗MG靶点PPI网络的构建与分析:使用STRING数据库构建五指毛桃靶蛋白之间的相互作用网络(PPI)，将蛋白种类设置为"Homo sapiens"、最低相互作用阈值设为"medium confidence"，其余参数均保持默认操作。并通过CytoHubba插件中的Degree算法算出Degree值，以该值为参考，进而获得五指毛桃治疗MG的关键靶点。

1.6基因本体生物学过程(Gene-ontology biology process，GO)功能富集分析:利用David数据库对核心靶点蛋白进行GO功能富集分析，以P值前10且P<0.01表示具有统计意义，并利用在线作图工具进行可视化。

1.7京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析:利用David生物信息注释系统对核心靶点蛋白进行KEGG功能富集分析，以P<0.01表示具有统计意义。

1.8构建成分-靶点-通路网络:将筛选出的重要靶点蛋白、核心化合物及富集得到的信号通路导入Cytoscape 3.9.0软件绘制成分-靶点-通路网络。

1.9分子对接模拟:从中药-化合物-靶点网络中将基因靶点以degree值高低进行排序，以degree值的大小为筛选条件，选择关键靶点与五指毛桃的活性成分进行分子对接，在PubChem数据库中下载五指毛桃活性成分化合物的sdf结构的文件，导入到Chem3D 17.1软件中调整活性成分的空间构象，使其结合能达到最低，以利于后面模拟对接，并以mol2格式保存，经AutoDockTools 1.5.7处理后将文件保存为pdbqt格式。从PDB蛋白数据库中下载目标蛋白的三维晶体结构，利用PyMOL 2.5.0将目标蛋白中多余的水分子以及有机物除去，以PDB文件保存，再将目标蛋白导入AutoDockTools-1.5.7加氢、分配电荷、添加原子类型后保存为pdbqt格式文件。利用AutoDock vina 1.2.0结合CMD指令进行分子对接，用Pymol 2.5.0对得到的对接结果进行绘图。

2 结 果

2.1五指毛桃的化学成分筛选:文献检索获得五指毛桃总化学成分108种，其中主要化合物香豆素类共11种，包含补骨脂素、佛手柑内酯等，黄酮类成分22种，包含芹菜素、木犀草素等，苯丙素类化合物15种，酚类化合物7种，萜类化合物12种，甾体类化合物11种包含β-谷甾醇、β-胡萝卜苷等，以及25种其他类化合物。将获得的108种成分通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)，结合SwissADME数据库进行筛选，筛选得到17种有效成分，为木犀草素、金合欢素、山柰酚、金合欢素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、补骨脂素、佛手柑内酯、水合橙皮内酯、紫花前胡苷元、角鲨烯、β-谷甾醇、豆甾醇、齐墩果酸、柚皮素、环桑根皮素、大黄素、大黄素甲醚。

2.2五指毛桃化学成分潜在靶点的预测与筛选:将得到的17种化合物通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)进行靶点预测，少数中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)中没有相关靶点的，则通过PubChem数据库下载的SDF文件通过Swiss Target Prediction网站进行预测，得到共计144个相关靶点，根据Cytoscape 3.9.0的插件CytoHubba计算Degree值，结果显示，与靶点连接度较高的化合物为槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、大黄素、金合欢素以及佛手柑内酯(Top 7)。而较为关键靶点为PTGS2、PTGS1、NCOA2、TOP2A、HSP90-1(Top 5)。

2.3五指毛桃“重症肌无力(Myasthenia Gravis)”病症相关靶点:以"Myasthenia Gravis"关键词在Genecard数据库和OMIM数据库搜索，在Genecard中找到了788个靶点，在OMIM中找到了64靶点，去除重复的50个靶点后，共获得802个疾病相关基因。最终筛选出疾病相关靶点与五指毛桃有效化学成分靶点中的30个交集靶点(图1)。

图1 疾病与五指毛桃有效化学成分的交集靶点韦恩图

2.4蛋白相互作用网络的构建与核心基因筛选结果分析:将交集靶点导入String 11.0数据库获取蛋白互作数据信息(图2)，将交集靶点导入String 11.0数据库获取蛋白互作数据信息(图2)，构建PPI网络，并将得到的结果导入Cytoscape 3.9.0软件，计算Degree值(CytoHubba插件中的Degree算法)，选取在前8的靶点蛋白(表1)，即在PPI中发挥了关键作用的靶点蛋白。以Degree值为筛选条件，TNF(22)、IL6(21)、EGFR(21)、IL1B(20)、TP53(20)、JUN(20)、ESR1(20)、VEGFA(19)是网络中Degree值较大的节点(图3)，推测这些靶点可能为五指毛桃治疗重症肌无力的核心靶点。将这些靶点与化合物匹配，找出与这8个靶点关联的化合物总计8个，分别为木犀草素、金合欢素、山柰酚、槲皮素、水合橙皮内酯、紫花前胡苷元、柚皮素、大黄素。

图2 PPI网络

表1 关键靶点的Degree参数

图3 8个核心靶点关系图

2.5基因本体生物学过程(gene-ontology biology process，GO)功能富集分析结果:在GO功能富集分析中，共得到159条条目，其中生物过程(Biological Process，BP)占128个、分子功能(Molecular Function，MF)占10个、细胞组分(Cellular Component，CC)占21个。以P<0.01为筛选条件，得到的结果中生物过程条目主要涉及一氧化氮生物合成过程的正向调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、ERK1/ERK2次级通路、DNA模板转录的正调控、平滑肌细胞增殖的正向调控、基因表达的正向调控、正调控的序列特异性DNA结合转录因子活性等生物过程；细胞组分(Cellular Component，CC)条目仅涉及细胞外间隙、细胞表面、胞外区、分泌颗粒、薄膜；而分子功能(Molecular Function，MF)主要包括相同的蛋白质结合、细胞因子活性、酶结合、染色质结合、蛋白质异质二聚体的活性、转录调控区DNA结合、一氧化氮合酶调节剂的活性、转录因子结合等分子功能，将以上导入微生信网站作图，如图4所示。

图4 GO分析富集图

2.6京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopediaof genes and genomes，KEGG)通路富集分析:KEGG通路富集分析共富集出55条信号通路，根据P<0.01进行筛选，得到31条信号通路。对这31条条目进行整合分析，发现其中主要涉及三大类：在抗炎方面发挥作用的信号通路、与免疫系统相关，提高免疫能力的信号通路以及癌症相关的信号通路。其中富集出的通路最多归于免疫系统方面，共计13条，如单纯疱疹感染、南美锥虫病(美洲锥虫病)、甲型流感、疟疾、沙门氏菌感染、麻疹等。第二大类为抗炎通路，共有11条，如：类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)、乙型肝炎以及toll样受体信号通路、T磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K-Akt)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等。癌症相关的信号通路最少，仅占6条，分为癌症相关的途径，如癌症中的蛋白多糖的合成代谢，非酒精性脂肪肝(NAFLD)，和一些具体癌症：膀胱癌、胰腺癌；以及一条与基因转录相关的雌激素信号通路。见图5。

图5 KEGG通路富集分析

2.7构建成分-靶点-通路网络:将8个靶点蛋白、8个化合物及31条信号通路导入Cytoscape 3.9.0软件绘制“成分-靶点-通路”网络(图7)。以化合物、靶点蛋白、信号通路的连接度为参考，木犀草素、槲皮素连接度值显著高于其他6个化合物，推测二者为五指毛桃治疗MG的核心活性成分；TNF、IL6、IL1B、JUN四个与抗炎作用关系密切的靶点与化合物、信号通路皆有较高的连接度，推测这四个靶点能在五指毛桃治疗MG过程中发挥一定与抗炎相关的作用；31条通路中有14条通路连接度高于其他17条通路的连接度，整合统计，8条为抗炎相关通路，4条为免疫系统相关通路，2条为与癌症相关通路，因此，推测五指毛桃可能通过发挥抗炎、提高自身免疫能力等功能作用治疗MG。见图6。

图6 靶点-化合物-信号通路图

2.8分子对接结果:在蛋白互作图中，以Degree值为参考筛选出的8个靶点：TNF、IL6、EGFR、IL1B、TP53、JUN、ESR1、VEGFA，匹配其所对应的化合物。以上述8个靶点、8个化合物作分子对接，从PDB数据库获得靶点对应的所需文件，做删除有机物、水分子及加氢分配电荷处理。通过PyMOL 2.5.0进行预处理，使用AutoDock Vina 1.2.0结合CMD命令符进行分子对接，得到分子对接验证结果，如表2所示。通过分子对接得到共21个“靶点蛋白-活性分子”，根据相关文献进行判断[13]，大部分化合物与靶点的结合都具有较好的活性，如木犀草素和靶点JUN的结合(-5.4)、金合欢素和靶点TP53的结合(-6.1)、大黄素与靶点IL1B的结合(-6.3)等。一些化合物和靶点具有较强的结合活性，如木犀草素与靶点IL6(-7.3)、EGFR(-8.2)、TNF(-9.1)的结合；山柰酚和靶点TNF的结合(-8.8)；懈皮素与靶点JUN(-7.2)、TNF(-7.4)、IL6(-7.5)、EGFR(-8.4)的结合；紫花前胡苷元和靶点ESR1的结合(-8.6)；大黄素与靶点TP53(-7.4)、TNF(-9.1)的结合；柚皮素与靶点ESR1(-8.6)的结合。

表2 五指毛桃有效活性成分与对应核心靶点的分子对接

3 讨 论

重症肌无力(Myasthenia Gravis，MG)属于中医萎证范畴，因先天禀赋不足、后天失养，或因情志刺激、感受外邪、月经来潮、体虚劳倦太过导致脾胃虚损，继而累及五脏发病，病机以脾胃虚损为本[9]。现代医学认为其由遗传、环境、自身免疫系统以及抗炎因子等因素诱发，而其中免疫、炎症被认为是导致MG的重要因素[10]。五指毛桃，为性味甘温之补益药，其补中提气，滋益脾肺之功恰好符合诸多中医学家治疗MG的核心思路：补脾益气。相关药理学研究表明：五指毛桃能显著提高环磷酞胺所致免疫功能低下小鼠碳粒廓清指数、胸腺和脾脏质量指数及血清溶血素水平，揭五指毛桃能够提高机体免疫力功能，对于导致MG的主要病因：脾胃虚损和自身免疫力缺陷都有良好治疗效果[11]。

3.1潜在有效成分分析:本研究通过网络药理学方法初步筛选出8个潜在活性成分，其中发挥关键作用的活性成分包括即木犀草素(Luteolin)，金合欢素(Acacetin)、山柰酚(Kaempferol)、柚皮素(Naringenin)、紫合橙皮内酯(Meranzin Hydrate)、槲皮素(Quercetin)等。既往大量研究已证实上述活性成分具有抗炎及免疫调节等功效。

研究表明木草犀素能通过与IL-10的正相关调控与IL-6、TNF-α的负相关调控从而发挥较强的抗炎作用[12]。柚皮素可以通过负相关调控IL-1β、IL-6和TNF-α基因，为脂多糖诱导的H9c2心肌细胞的炎症反应和细胞凋亡提供帮助；金合欢素具有抗肿瘤入侵和迁移能力，在其作用下，IL-6，IL-8，细胞间黏附分子-1等抗炎因子活性都会显著降低[13,14]。

槲皮素是一种天然存在的多酚类黄酮，实验表明槲皮素能抑制AGEs/RAGE/NF-κB炎症通路，同时能抑制炎症因子IL-1B、TNF的产生，并具有对丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的抑制作用。山奈酚是一种结构与懈皮素相似的生物类黄酮，具有抗炎和抗肿瘤特性。与槲皮素相似，同样能降低促炎因子( IL-1B和TNF)的表达。

检索文献发现，除了对炎症和免疫信号通路的调节外，部分关键活性成分还具有抑制胆碱酯酶(AChE)活性的作用[15]。众所周知，抑制AChE的活性是治疗神经肌肉接头突触病变MG的重要环节，而后天合成的胆碱酯酶抑制剂为西医治疗MG的重要途径之一，根据文献记载，数百种天然化合物具有抗胆碱酯酶活性，例如∶生物碱、香豆素、黄酮类等等，但生物碱等化合物的毒性限制了它们在医学治疗中的广泛使用，相比之下，黄酮类化合物不具有这种副作用，可用于疾病的长期治疗。

槲皮素可通过浓度依赖的方式作为乙酰胆碱酯酶(AchE)的竞争性抑制剂，减少乙酰胆碱(Ach)的水解，从而增加了突触间隙之间的Ach水平。高剂量的槲皮素可显著降低帕金森病动物模型中海马匀浆的AChE 活性 。药用金盏花提取物对中枢和外周神经系统具有广泛的生物活性，对西伯利亚引入的 23 种品类的金盏花的研究发现，其中黄酮类化合物∶槲皮素和异鼠李素衍生物，均以糖苷的形式存在，与其他化合物比起来，显示出最高的抗胆碱酯酶活性潜力，提示异鼠李素和槲皮素及其糖苷可被视为潜在的抗乙酰胆碱酯酶剂预防神经退行性疾病。Jung M等用乙酸乙酯从药用植物仙鹤草中提取出四种黄酮类化合物，而其中抑制AChE效果最好的是槲皮素。

因此，五指毛桃可能通过槲皮素、山奈酚、木犀草素、金合欢素等有效活性成分抗AChE活性、抗炎和调节免疫等作用靶向治疗MG，同时也证实上述化合物有极大研究空间，为治疗MG的药物开发提供参考。

3.2关键靶点与信号通路分析:研究结果表明，五指毛桃治疗MG的靶点主要集中在TNF、IL6、IL1B、TP53、JUN、ESR1等，通路主要富集在TNF、T细胞受体、Toll 样受体(TLR)、PI3K-Akt信号通路、MAPK等信号通路，这些靶点与通路之间存在着显著的相互作用关系。

查阅文献，ESR1靶点可能与介导胸腺瘤的MG相关[16]。ESR1为介导雌激素发挥生物学作用的核内蛋白，而雌激素通过减少TNF、IL-6等抗炎细胞因子的合成和分泌可以作用于巨噬细胞和T细胞等免疫细胞，胸腺是雌激素作用于免疫系统的主要靶器官，且雌激素与胸腺内的ER结合易导致MG胸腺的萎缩，相关实验表明雌激素可通过雌激素受体达到对人体免疫系统的影响，也能推测雌激素可通过ESR1介导与胸腺有关的自身免疫疾病。此外，通过KEGG富集的癌症中的蛋白多糖的合成代谢通路及胸腺癌通路也能与ESR1靶点介导的一系列影响形成对应。

MAPK(原活化蛋白激酶)信号通路涉及触发细胞反应的环境和发育信号的转导，包括存活、增殖、分化、炎症和细胞凋亡。通常，哺乳动物细胞中的MAPK 由三个不同的组组成，即细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK)和p38激酶。其中p38a(MAPK14)可作为中心途径通过对树突状细胞(DC)进行编程以调节介导自身免疫的辅助T细胞的分化。而炎症细胞因子如TNF、IL-6 和 IL-1B是MAPK14的原型激活剂，MAPK14的激活响应病毒感染并可能调节病毒复制。

Toll样受体(TLR)是一种膜结合受体，在炎症因子释放时，TLR能够识别病原，激活自身免疫系统产生抗炎因子(TNF、IL-B等)，与先天及后天获得性免疫都密切相关[17]。而现代研究表明，病毒感染与MG存在一定联系。Heckmann JM等报道过17例人类免疫缺陷病毒(HIV)感染与MG并病的病例，WangY等也报道过1例HIV感染者在接受抗逆转录病毒治疗治疗后被诊断为MG，这也可能为在KEGG中富集到HIV等病毒感染通路的部分原因。此外Cavalcante P等发现先天免疫的关键激活剂TLR4在一些MG患者的胸腺中过度表达，且脊髓灰质炎病毒感染的巨噬细胞存在于一些MG患者的胸腺中，表明病毒对于因胸腺诱发MG的患者有一定影响。

综上所述五指毛桃可能通过介导 TNF、IL6、IL1B、TP53、JUN、ESR1等关键靶点调控免疫应答、炎症、病毒感染等信号通路治疗MG。