孙鹏 嵇俊

丙型肝炎是由丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）引起的一种以肝损害为主的一组全身性传染病疾病,其可发展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌，给患者的生命安全带来了严重的威胁[1]。我国是丙型肝炎的高流行区，传播途径以输血、针刺及吸毒等方式为主，其中输血传播较常见，经输血、血液制品传播疾病[2-3]，流行病学显示，此病在全球中感染率约占3%，感染者约有2亿人，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例，其中50%～80%的感染者无明显症状并可进展为慢性感染，20%的感染者最终可进展为肝硬化甚至肝细胞癌[4-6]。且由于患病率逐年升高，已成为严重的社会、公共卫生问题。由于目前尚无疫苗和特效药物，对无偿献血人群进行的筛查和早期诊断已成为控制临床输血性丙型肝炎传播的重要手段。血站目前普遍采用第三代间接法检测抗-HCV，该方法检测能力虽有所提高，但在灵敏度、特异性以及检测窗口期方面仍存在明显不足，如何进一步提高酶联免疫法HCV抗体的检测效能，成为采供血机构亟待解决的问题之一。有鉴于此，实验室拟对优化的第四代双抗原夹心法HCV抗体检测试剂进行验证，并在实践中加以引进和应用。现将工作汇报如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象为，（1）选择2020年10月13日—2021年12月31日在淮安市中心血站无偿献血阴性样本83 209例，2020年第三代试剂抗-HCV单试剂阳性而HCV-RNA检测阴性标本28例，合计83 237例。（2）11例阳性样本:经江苏省血液中心确认抗-HCV为阳性归队样本5例；HCV抗体酶免阴性而HCV-RNA阳性样本2例；2020年卫健委临检中心测评HCV-RNA阳性样品4例，合计11例。（3）北京康彻思坦丙型肝炎病毒抗体性能验证血清盘精密度样本24例，阴性及阳性样本各20例。

1.2 方法

（1）采用试剂盒内的阴、阳性对照和抗-HCV质控品，在不低于10 d试验运行前提下，累计进行至少20批次常规检测，每批次试验包括空白对照1孔，阳性对照2孔，阴性对照3孔，室内质控1孔，汇总各批数据分析其重复性。（2）取参考血清盘中精密性样品（0.1 NCU/mL），在不低于10 d试验运行的前提下，累计进行24次常规检测；将上述标本插入常规标本序列，一批内进行24次检测。汇总各组数据，计算其批间、批内精密度。（3）取参考血清盘中已知血清状态标本共40份，插入常规检测，汇总数据计算其敏感性、特异性和准确度。（4）取江苏省血液中心新近确认HCV核酸阳性归队标本、以往HCV酶免阴性而核酸阳性标本、2020年卫健委室间质评核酸阳性标本，共计11例作为HCV抗体确证阳性试验组；取原第三代酶免试剂阳性而核酸阴性标本、本室2020年10月13日—2021年12月无偿献血者阴性样本，二者共计83 237例（以核酸检测结果为确认标准），作为HCV抗体确证阴性试验组。汇总各组检测结果并做统计分析。

仪器与试剂：加样设备为Microlab Star全自动加样仪，由瑞士哈美顿博纳图斯股份公司提供。全自动酶联免疫后处理系统为FAME24/20，由瑞士哈美顿博纳图斯股份公司提供。均定期检定校验合格。

北京万泰双抗原夹心法酶联免疫抗-HCV检测试剂（批号CS20200708、CS20200810、CS20201114、CS20210101、CS20210507、CS20210810）、厦门新创间接法酶联免疫抗-HCV检测试剂（批号2019125825）、上海科华间接法酶联免疫抗-HCV检测试剂（批号202002041、202008121、202008141、202102041、202106151）。北京康彻思坦室内质控品（抗-HCV含量0.05 NCU/mL，批号: 202005010、202007002、202107013）、北京康彻思坦肝炎病毒抗体性能验证血清盘（批号J202004002），均按照使用说明要求操作并在有效期内使用。

1.3 观察指标

（1）酶联免疫吸附法（ELISA）样品反应孔吸光度值（absorbance，A）＜临界值（cut off，CO），判为HCV抗体阴性；样品反应孔A值≥临界值（cut off，CO），判为HCV抗体阳性。

（2）重复性试验符合率=样本实际阴性（阳性）数/血清盘确认阴性（阳性）数×100%；精密度试验以样本吸光度值/临界值（S/CO）作为统计观察指标，计算S/CO均值和变异系数（coefficient of variation，CV）。

本文参照国家标准《血站技术操作规程（2019 版）》中关于重复性和精密度试验的执行标准执行：重复性试验可接受标准为20次检测结果不能出现大于1次阴性阳性对照不符合生产商要求；精密性试验可接受标准为批内变异系数应在15%以内，批间变异系数应在20%以内；

（3）敏感性=真阳性例数/诊断金标准阳性例数×100%；特异性=真阴性例数/诊断金标准阴性例数×100%；准确度=(真阳性例数+真阴性例数)/总例数×100%；阳性检出率=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性检出率=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%。

1.4 统计学方法

用统计软件SPSS 23.0统计学软件进行统计学分析，计数资料以n（%）表示，行χ2检验，计量资料以（±s）表示，行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阴、阳性对照重复性试验结果

由阴、阳性对照重复试验可知：60孔阴性对照A值均≤0.1，符合率达到100%；40孔阳性对照OD值均≥0.80，符合率达到100%。此外，20孔空白对照在正常试验条件下未出现异常的显色或波动，符合率达到100%；20孔室内质控血清的吸光度值/临界值也均处于2～5之间。说明第四代试剂在本室的应用能够较好地满足实验要求。

2.2 批内、批间精密度试验结果

参考血清盘精密性样品（0.1 NCU/mL），按既定方案进行批内和批间精密度试验，批内和批间精密度均符合血站技术操作规程（2019）版相关规定，详见表1。

表1 批内和批间试验样本S/CO数据统计表

2.3 敏感性、特异性试验结果

取参考血清盘中已明确血清状态的阴、阳标本共40份，插入常规标本一同检测，共检出20份阴性和20份阳性结果，与参考血清盘真值符合率达100%。同时，按照单一检测方法2×2四格表资料统计，分别计算其敏感性和特异性，均为100%。说明该试剂盒在对各浓度参考学清样本具有很好的检出与鉴别能力。

2.4 第四代与第三代试剂平行比对实验结果比对

经第四代与第三代试剂的平行比对，其中阳性对照组11例，第四代试剂阳性检出率为81.82%，第三代试剂阳性检出率为27.27%，第四代试剂敏感性明显高于第三代试剂，差异有统计学意义（χ2=3.342，P＜0.05）；阴性对照组83 237例，第四代试剂阴性检出率为99.99%，第三代试剂阴性检出率为99.88%，第四代试剂特异性为99.99%，高于第三代的99.88%，差异有统计学意义（χ2=32.238，P＜0.05）。以上数据说明第四代试剂较第三代试剂在灵敏度和特异性等核心指标方面均表现出明显的优势。详见表2。

表2 第四代与第三代试剂平行试验数据统计（例）

3 讨论

丙型肝炎是丙肝病毒主要通过输血及血制品传播导致的一种严重传染性疾病，为达到控制输血传播HCV、保障临床供血安全的目标，必须采用敏感准确的方法对无偿献血的血样进行相关筛查。酶免疫分析（enzyme immunoassay，EIA）方法作为HCV抗体检测的重要手段，之前曾历经三代的技术发展。最早由美国Chiron公司于20世纪80年代末利用丙肝病毒抗原重组C100-3融合蛋白，构建出首代HCV抗体检测方法。它可在感染丙肝病毒12～26周后检测出抗体，但因其仅针对非编码抗原NS4区域设计，造成特异性差、灵敏度也较低。90年代初，出现以丙肝病毒抗原NS3区C33C与NS4区融合表达抗原C200、合并C区核心抗原C22-3作固相包被的第二代HCV抗体检测试剂盒。它弥补了首代方法的部分不足，使HCV抗体检测的敏感性和特异性有所提高。研究显示，其检出率较首代检测方法提高5%～40%，同时由于抗C33C比抗C100-3早出现30～90 d，可使窗口期进一步缩短至10周左右。进入21世纪，国内的采供血机构已经普遍采用第三代酶联免疫间接法检测HCV抗体，它是在第二代的基础上，增加了一个非编码抗原NS5，不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还令检验窗口期又缩短了1周左右。总体而言，这些EIA检测抗体技术兼具价格低廉、快捷简便、自动化程度高等优点，但基于方法学上的缺陷，其不可避免易受诸多因素的影响，如试剂抗原、抗体与酶结合物不纯；献血者血样溶血或有高免疫蛋白、类风湿因子和超氧化物歧化酶等的存在；操作过程中加样时间、孵育状态、震荡程度、洗板效果等因素的波动均会造成检测结果的偏差。尤其需要关注的是其窗口期问题，由于丙肝病毒从感染到抗体产生期限较长，造成其血清转阳时间也偏长，需进一步缩短检出周期才能切实减少威胁输血安全的隐患[8-10]。

血站目前普遍采用第三代间接法检测抗-HCV。科学研究表明，人体感染丙肝病毒后，机体出现的生理性免疫学反应具有一定的规律，由于IgG类抗体出现的时间迟缓,造成目前采用酶联免疫间接法来检测的第三代HCV抗体试剂，对早期感染者采集的血样不够敏感，且众多的干扰因素，还会导致一定的假阳性。西部战区总医院就曾对献血者中经2个厂家试剂ELISA HCV抗体试剂进行检测为阳性的137份样本进行重组免疫印迹法确证，假阳性率高达35.29%[11]。本次研究所涉及的酶免双抗原夹心法HCV抗体检测试剂，采用基因工程重组表达抗原作为原料取代原先使用的酶标二抗，提高了检测特异性，随着灰区和假阳性标本的大量减少，避免了不必要的献血资源的浪费及医疗纠纷。其次，该试剂在间接法检测IgG的基础上，增加了针对IgM类抗体的检测，由于IgM在人体的免疫反应中早于IgG出现，这样就可使窗口期提前7～30 d；同时，借助生物素-亲和素级联放大技术也提高了检测灵敏度，其最低检出限可达0.2 NCU/mL，降低了丙肝病毒的传播风险；另外，双抗原夹心法HCV抗体检测利用对抗体进行两次特异性反应，形成包被抗原-抗体-标记抗原复合物，可降低间接酶联免疫吸附法引起的假阳性[12]；其加样量由间接法的10 μL提高到50 μL，避免挂针等造成的误差，保证了实验操作的稳定性和检测的重复性，也降低输血的风险以及血液筛查的成本。

综上所述，在目前血站行业标准为开展核酸检测同时至少进行1次血清学检测，且采用先血清学检测再对阴性标本进行核酸筛查的检验策略为背景下,通过本次研究并立足长远考量，不管是对双抗原夹心法HCV抗体检测试剂自身精密度、重复性、敏感性、特异性、抗干扰性以及最低检出限的验证，还是与第三代酶免间接法HCV抗体试剂的比对，均显示出双抗原夹心法HCV抗体检测试剂优越的检测性。选择酶免双抗原夹心法HCV抗体检测试剂相较于第三代酶免间接法试剂，不仅灵敏度高，能有效降低传播风险，而且假阳性少，可减少不必要的血液资源浪费，避免给献血者带来无谓的心理负担，在一定程度上减少献血者的流失。此外，应用双抗原夹心法HCV抗体检测试剂也能更好地整合并发挥血清学与核酸联检的效能，进一步促进无偿献血工作的开展、提高临床用血安全的保障水平。