吕 悦，张颖慧，孙宇婷，张 良，张 琳*，祖元刚

(1.东北林业大学化学化工与资源利用学院森林植物生态学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040；2.东北林业大学化学化工与资源利用学院林业生物制剂教育部工程研究中心，黑龙江哈尔滨 150040；3.东北林业大学化学化工与资源利用学院生物资源生态利用国家地方工程中心，黑龙江哈尔滨 150040；4.黑龙江省林源活性物质生态利用重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040；5.黑龙江中医药大学附属第二医院南院，黑龙江哈尔滨 150060)

半夏为天南星科植物半夏[Pinelliaternata(Thunb.)Berit.]的干燥块茎，具有镇咳、祛痰、止呕等作用[1]。有研究报道半夏是有毒的，主要表现为强烈的黏膜刺激性(胃、肠道及咽喉)和肝脏损伤。王丽[2]将半夏总生物碱富集物提取出来，发现可导致小鼠肝损伤。中医药研究发现通过炮制可实现中药的减毒增效[3]。因此半夏生品多外用，临床上以炮制品(清半夏、姜半夏和法半夏)为主。清半夏为生半夏经白矾溶液浸泡所得，毒性低，增强化痰作用；姜半夏为生半夏与生姜、白矾同煮晾干所得，毒性已减，止呕作用增强；法半夏为生半夏用甘草、石灰和白矾制后得到，燥性较为和缓，常用于消食化痰[4-5]。经过不同方法炮制后，半夏毒性明显降低，但其主要毒性成分及含量还不是很明确。

半夏中所含化学成分种类很多，其中生物碱类化合物被认为是主要有效成分之一，但部分生物碱是有毒性的[6]。Zhai等[7]采用UPLC/Q-TOF-MS/MS对16份生半夏、制半夏进行分析，初步鉴定了溶血磷脂酰胆碱为特征标记物，溶血磷脂酰胆碱可诱导炎症反应，因此半夏中溶血磷脂酰胆碱的降低是解毒的主要原因之一。据文献报道，尿黑酸[8]、原儿茶酸和原儿茶醛[9]被认为是半夏辛辣味本质，对黏膜具有强烈刺激性。大黄酚是大黄中蒽醌类化合物，有肝脏毒性以及致癌的风险[10]。有研究表明，半夏经炮制后毒性会减弱，这可能与在炮制过程中半夏毒性成分的含量变化密切相关[5]。

目前，半夏的毒性研究主要集中在毒性成分的探析上，但比较炮制前后半夏毒性成分含量变化的研究报道较少。生物碱类成分紫外吸收较弱[11]，常规方法往往难以达到检测目的，因此液质联用法是生物碱类成分测定的首选。该研究通过查阅文献对半夏炮制品的化学成分进行筛选，筛选得到溶血磷脂酰胆碱、盐酸麻黄碱、葫芦巴碱、胆碱、原儿茶酸、原儿茶醛、尿黑酸和大黄酚这8种潜在毒性成分，采用超高效液相串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定半夏中8种潜在的毒性成分，并测定其在半夏不同炮制品中的含量，利用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)[12]对炮制前后半夏中毒性成分含量进行分析，探讨这些潜在毒性成分含量变化与半夏不同炮制方法之间的相关性，为半夏炮制品的毒性评价和质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器1290-QQQ6460型超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪(美国Agilent公司)；UP-400S超声波细胞破碎仪(上海熙扬仪器有限公司)；ME104电子天平(梅特勒公司)；SUS 304中药粉碎机(圣顺公司)。

1.2 药材与试剂生半夏、姜半夏、法半夏、清半夏均购自四川成都康巴高原山珍中药材基地，经国药集团黑龙江省药材公司中药师张军鉴定均为正品。溶血磷脂酰胆碱(纯度≥98%)、苦参碱(纯度≥98%，内标物)均购自成都德思特生物有限公司；盐酸麻黄碱(纯度≥99%)、野黄芩苷(纯度≥98%，内标物)均购自中国食品药品检定研究院；葫芦巴碱(纯度≥98%)、胆碱(纯度≥90%)、原儿茶酸(纯度≥98%)、原儿茶醛(纯度≥98%)、尿黑酸(纯度≥98%)、大黄酚(纯度≥98%)均购自上海源叶生物有限公司；甲醇购自J&K Scientific；水为娃哈哈纯净水。

1.3 试验方法

1.3.1标准品溶液制备。分别精密称取溶血磷脂酰胆碱、盐酸麻黄碱、葫芦巴碱、胆碱、原儿茶酸、原儿茶醛、尿黑酸、大黄酚的标准品各10 mg，加一定量甲醇至10 mL，得浓度为1.0 mg/mL的标准品溶液。取各标准品溶液等量，加甲醇得浓度为2.0 μg/mL的混合标准品溶液，再进一步稀释到不同浓度。精密称量野黄芩苷、苦参碱标准品各5 mg，分别制得浓度为1.0 mg/mL，作为内标溶液(IS)。取上述配制的不同浓度混合标准品溶液500 μL，加入甲醇490 μL、内标溶液10 μL，混均，留存备用。

1.3.2样品溶液制备。将生半夏、姜半夏、法半夏、清半夏粉碎，过筛(60目)，备用。取半夏不同炮制品粉末各5.0 g，精密加入甲醇50 mL，并向其中加入内标溶液10 μL，超声波细胞破碎仪(功率360 W)提取30 min。连续提取2次，过滤，合并滤液。10 000 r/min离心10 min，取上清液进行UPLC-MS/MS测定。

1.3.3超高效液相色谱-质谱联用条件。HPLC色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSST3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，流动相为甲醇-水溶液，进样量4 μL，流速0.3 mL/min，柱温30 ℃。梯度洗脱程序为0～6 min，25%～100%甲醇；6～10 min，100%甲醇。电喷雾离子源(ESI)作为质谱离子源，载气为氮气。扫描方式为正负离子同时检测，以多反应检测(MRM)模式扫描。其他质谱条件：干燥气流量为11.0 L/min，毛细管电压为3 000 V，离子源温度为350 ℃，雾化气压力为137.9 kPa。8种潜在毒性成分以及内标物的MRM质谱参数见表1。

表1 8种潜在毒性成分以及内标物的主要质谱参数Table 1 Main mass spectrometric parameters of the 8 poential toxic compounds and IS

1.3.4方法学考察。

1.3.4.1线性关系考察。取不同浓度范围的各标准品溶液按照“1.3.3”的条件进行UPLC-MS/MS测定(平行测定3次)。以各标准品的浓度与IS(正离子扫描模式的IS为苦参碱，负离子扫描模式的IS为野黄芩苷)浓度的比值为横坐标(X)、峰面积与IS峰面积的比值为纵坐标(Y)进行线性回归，计算各标准品的回归方程、相关系数和线性范围。

1.3.4.2检出限与定量限。将线性范围最低浓度的标准品溶液进行稀释，进样检测，定量限(LOQ)为信噪比S/N=10时的标准品浓度，检出限(LOD)为信噪比S/N=3时的标准品浓度。

1.3.4.3精密度试验。取混合标准品溶液适量，按“1.3.3”的条件连续进样6次，得到8种毒性成分的RSD值，检测仪器精确度。

1.3.4.4重复性试验。取生半夏样品6份，按“1.3.2”方法制备样品溶液，按“1.3.3”的条件测定样品中各成分的含量，并计算各成分的RSD值，检测该方法的重现性。

1.3.4.5稳定性试验。取生半夏样品6份，按“1.3.2”方法制备样品溶液，室温存放0、1、2、4、8、12、24 h，按照“1.3.3”的条件测定样品中各成分的含量，并计算各成分的RSD值，检查样品的稳定性。

1.3.4.6加样回收率试验。取6份含量已知的生半夏粉末，每份约2 g，将相应标准品溶液加至每份样品中，按“1.3.2”方法制备样品溶液，按“1.3.3”的条件测定样品中各成分的含量，并计算各成分的RSD值。

1.3.5半夏生品及其炮制品8种潜在毒性成分的含量测定。取生半夏(SBX)、姜半夏(JBX)、法半夏(FBX)、清半夏(QBX)粉末，按照“1.3.2”方法制备样品溶液，按照“1.3.3”条件进行测定，记录峰面积，计算半夏生品及其炮制品中8种潜在毒性成分的含量。

2 结果与分析

2.1 对照品与样品的色谱图图1为半夏标准品和样品的UPLC-MS/MS的色谱图。如图所示，利用梯度洗脱法测定8种毒性成分的分离效果良好，出峰时间适中。在MRM模式下的色谱图显示，溶血磷脂酰胆碱、胆碱、葫芦巴碱、盐酸麻黄碱、苦参碱、尿黑酸、原儿茶醛、原儿茶酸、大黄酚、野黄芩苷的保留时间分别为7.068、0.642、0.825、0.992、0.822、0.696、1.279、1.182、5.828、2.999 min，各峰分离良好，标准品溶液与样品溶液目标峰的保留时间吻合，灵敏度高，峰形良好。

注：1.溶血磷脂酰胆碱；2.胆碱；3.葫芦巴碱；4.盐酸麻黄碱；5.苦参碱；6.尿黑酸；7.原儿茶醛；8.原儿茶酸；9.大黄酚；10.野黄芩苷。a1～a5、b1～b5为正离子模式；a6～a10、b6～b10为负离子模式。Note：1.Lysophosphatidylcholine；2.Choline；3.Trigonelline；4.Ephedrine hydrochloride；5.Matrine；6.Homogentisic acid；7.Protocatechuic aldehyde；8.Protocatechuic acid；9.Chrysophanol；10.Scutellarin.a1～a5，b1～b5 are positive ion modes；a6～a10 and b6～b10 are negative ion modes.图1 半夏标准品(a)和样品(b，生半夏)UPLC-MS/MS色谱图Fig.1 UPLC-MS/MS chromatogram of Pinellia ternata standard(a)and sample(b，raw Pinellia ternate)

2.2 方法学考察

2.2.1线性关系。按“1.3.4.1”方法操作，结果见表2。从表2可以看出，8种潜在毒性成分在各自范围内具有良好的线性关系(R2≥0.999)。

2.2.2检出限与定量限。按“1.3.4.2”方法操作，结果见表2。从表2可以看出，溶血磷脂酰胆碱、尿黑酸的定量限均为0.5 ng/mL，检出限均为0.1 ng/mL；盐酸麻黄碱和原儿茶酸定量限均为0.5 ng/mL，检出限均为0.2 ng/mL；葫芦巴碱定量限为0.4 ng/mL，检出限为0.1 ng/mL；胆碱、原儿茶醛和大黄酚定量限均为0.3 ng/mL，检出限均为0.1 ng/mL。

表2 8种潜在毒性成分的回归方程、决定系数、线性范围、定量限和检出限Table 2 Regression equation，determination coefficient，linear range，quantitative limit and detection limit of 8 poential toxic components

2.2.3精密度试验。按“1.3.4.3”方法操作，测得溶血磷脂酰胆碱、胆碱、葫芦巴碱、盐酸麻黄碱、原儿茶酸、原儿茶醛、尿黑酸和大黄酚的RSD值分别为3.99%、3.02%、4.82%、3.78%、3.67%、6.78%、3.26%、5.66%，均不超过10%，表明该仪器的精密度良好。

2.2.4重复性试验。按“1.3.4.4”方法操作，测得溶血磷脂酰胆碱、胆碱、葫芦巴碱、盐酸麻黄碱、原儿茶酸、原儿茶醛、尿黑酸、大黄酚的RSD值分别为1.74%、5.81%、3.09%、3.68%、2.19%、4.75%、3.64%、7.85%，均不超过10%，表明该方法重复性良好。

2.2.5稳定性试验。按“1.3.4.5”方法操作，测得溶血磷脂酰胆碱、胆碱、葫芦巴碱、盐酸麻黄碱、原儿茶酸、原儿茶醛、尿黑酸、大黄酚的RSD值分别为3.94%、5.45%、4.67%、3.12%、3.86%、6.63%、3.76%、4.44%，均不超过10%，表明样品溶液在室温下放置24 h基本稳定。

2.2.6加样回收率试验。按“1.3.4.6”方法操作，测得溶血磷脂酰胆碱、胆碱、葫芦巴碱、盐酸麻黄碱、原儿茶酸、原儿茶醛、尿黑酸、大黄酚的RSD值分别为1.83%、2.18%、2.28%、1.25%、2.46%、2.73%、3.90%、2.66%，均不超过10%，表明该方法准确性良好。

2.3 半夏生品及其炮制品中8种潜在毒性成分的含量分析从表3可以看出，总体来看，半夏炮制前后8种潜在毒性成分的总量从高到低依次为生半夏>清半夏>姜半夏>法半夏。而在半夏不同炮制品中，生半夏中的溶血磷脂酰胆碱、胆碱、葫芦巴碱、原儿茶酸和大黄酚最多，法半夏的最少，溶血磷脂酰胆碱、原儿茶酸和大黄酚的含量顺序为生半夏>清半夏>姜半夏>法半夏，盐酸麻黄碱的含量顺序为生半夏>清半夏>法半夏>姜关夏，胆碱、葫芦巴碱的含量顺序为生半夏>姜半夏>清半夏>法半夏，原儿茶醛的含量顺序为姜半夏>清半夏>生半夏>法半夏，尿黑酸的含量顺序为清半夏>法半夏>姜半夏>生半夏。

表3 半夏生品及其炮制品中8种潜在毒性成分含量测定结果Table 3 Determination results of 8 potential toxic components in raw Pinellia ternata and its processed products 单位：mg/g

2.4 多元统计分析

2.4.1主成分分析(PCA)。主成分分析是一种多变量统计方法，用于分析多个变量之间的相关性[13]。该研究中，PCA被用来分析半夏生品及炮制品之间毒性成分的差异。选取半夏生品及其不同炮制品各5份，按照“1.3.2”方法制备样品溶液，按照“1.3.3”条件测定半夏生品及其炮制品中溶血磷脂酰胆碱、胆碱、葫芦巴碱、盐酸麻黄碱、原儿茶酸、原儿茶醛、尿黑酸、大黄酚的含量。利用Origin 9.1软件对半夏生品及其炮制品中8种潜在毒性成分含量进行PCA分析，得到Score plot图(图2)。

由图2可知，按照8种潜在毒性成分含量来划分，半夏生品与其炮制品聚集成4类，表明他们之间存在一定差异性。样品间相离越远表示差异性越大，姜半夏(JBX1～JBX5)和清半夏(QBX1～QBX5)分布的距离较小，表明姜半夏与清半夏的毒性成分含量差异较小。

2.4.2偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)。为更好地观察生品与不同炮制品之间毒性成分的差异，采用监督模式识别方法的偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)。根据PLS-DA筛选出半夏生品及其炮制品潜在标志性差异成分[12]。利用SIMCA软件对炮制前后半夏的8种潜在毒性成分含量进行PLS-DA。

由PLS-DA得分(图3)可知，生半夏((SBX1～SBX5)、姜半夏(JBX1～JBX5)、清半夏(QBX1～QBX5)、法半夏(FBX1～FBX5)各自聚为一类，与PCA分析结果一致。FBX和JBX相邻，表明它们毒性含量差异较小。与PCA结果比较可知，生半夏与其炮制品(JBX、FBX和QBX)明显区分，表明生半夏与炮制品的毒性成分特征差异较大。

图2 半夏生品及其炮制品中含量PCA分析后的Score plot图Fig.2 Score plot of content in raw and processed Pinellia ternata after PCA analysis

为进一步寻找对上述样本分类有较大贡献的成分，该研究以变量重要性投影值(variable importance in projection，VIP)>1.0(即该变量对整体模型的贡献度高于平均水平)为标准，筛选出胆碱、盐酸麻黄碱和原儿茶酸3种成分是对半夏生品及其炮制品差异贡献较大的指标性成分，也可能是半夏炮制后毒性降低的相关成分(图4)。

图3 半夏生品及其炮制品的PLS-DA得分Fig.3 PLS-DA score of raw Pinellia ternata and its processed products

图4 半夏生品及其炮制品中8种毒性成分的VIP值Fig.4 VIP values of 8 toxic components in raw and processed Pinellia ternata

3 结论与讨论

该研究建立的UPLC-MS/MS分析方法，能够同时定量半夏生品及其炮制品中8种潜在毒性成分。试验过程中曾尝试过高效液相法测定，但因为溶血磷脂酰胆碱、盐酸麻黄碱的紫外吸收弱，且梯度洗脱过程中基线不稳定，而质谱具有灵敏度高、干扰性小等优点，所以采用UPLC-MS/MS为检测方法。在检测过程中，由于基质效应会引起检测信号发生变化，所以选择了合适的内标物来提高分析结果的准确度和精密度。另外8种潜在毒性成分性质相差极大，其中包括有机酸类和生物碱类，故采用多反应监测(MRM)法测定时，选择正离子检测和负离子检测2种模式测定8种潜在毒性成分的MRM离子对，定量离子峰形良好，没有其他物质的影响，能够精准定量待测物质。该研究所建立的方法分离能力强、灵敏度高、定量分析结果可靠、检出限低，可用于半夏中8种成分的含量测定，为后续的分析奠定方法学基础。

该研究对半夏中8种潜在毒性成分进行定量分析，得出8种潜在毒性成分总含量从高到低依次为生半夏>清半夏>姜半夏>法半夏，与高昌琨等[14]研究所得的毒性强弱结果一致，但通过研究证明尿黑酸和原儿茶醛经炮制之后含量降低，推测其可能不是半夏中含有的毒性成分。经PCA和PLS-DA分析，生半夏与不同炮制品之间毒性成分含量差异较大，胆碱、盐酸麻黄碱和原儿茶酸是造成样品间毒性差异的主要成分，可能是生半夏中潜在的毒性成分。该研究所建立的方法简便、可靠、灵敏度高，结合多元统计分析可用于分析半夏潜在毒性物质的基础，为生半夏炮制减毒的机理提供了可靠的分析方法和理论依据。