莫 峥，杨丽莉，周 鹏，黄纲临，徐 勇，王勇军，周 萍，李 萌

(红云红河烟草(集团)有限责任公司，云南昆明 650231)

烟叶在储存过程中受微生物、温度和湿度等影响极易发生霉变。烟叶霉变使其色泽变暗，香气遗失，吃味变差，刺激性增大，使用价值降低甚至丧失，给烟草加工企业造成经济损失[1]，早期烟叶霉变的快速识别已成为烟草行业亟待解决的关键问题。目前霉变烟叶的研究多集中于烟叶霉变原因探索和预防措施开发，如改变环境温湿度，使霉菌不宜生长等[2-3]，以及研究烟叶霉变微生物[4-6]。但由于烟叶储存堆码的原因，即使控制仓储环境的温湿度，小部分烟叶仍会霉变。烟叶霉变过程中使其挥发性代谢产物(MVOCs)发生变化，因此可通过监测烟叶霉变的挥发性代谢产物来判断烟叶霉变情况。研究显示，采用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱(HS-SPME-GC-MS)方法检测挥发性代谢产物是一种较为理想的技术[7]。此技术在预测烟叶霉变报道甚少[8]，但在其他行业已有应用报道。在玉米霉变研究中采用挥发性成分作为霉变标记物已有报道[4，9]。在谷物霉变研究中已有报道，谷物在储藏过程中醇类[10]、酯类[11]、酮类[12]、醛类[13-14]、脂肪酸[11]等物质的变化可能导致谷物发生霉变或劣变，对谷物品质产生严重影响。因此，测定烟叶霉变前后挥发性成分测定和筛查具有重要意义，可实现烟叶早期霉变的筛查，对烟叶霉变的提前预测和实时监控提供一种技术措施。该研究采用SPME结合GC-MS技术测定烟叶霉变特征标记物，建立烟叶霉变挥发性成分的测定方法，以期为霉变烟叶的识别及有效预防提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试材由云南中烟烟叶仓储库中随机抽取4份烟叶(包括2份K326和2份红花大金元烟叶，即K326 1#、K326 2#、红大1#、红大2#)，将各烟叶平均分为2份，其中一份用于后续模拟霉病试验，一份自然醇化，共计8份。

1.2 仪器与试剂7890B-5975B气相-质谱联用仪，美国安捷伦(Agilent)科技有限公司；HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美国安捷伦(Agilent)科技有限公司；AB-204电子分析天平，美国梅特勒(Mettler)公司；固相微萃取手柄，美国Supelco公司；75 μm Carboxen-PDMS固相萃取头(黑头)、85 μm PDMS/DVB固相萃取头(白头)、100 μm PDMS固相萃取头(红头)、7 μm PDMS固相萃取头(绿头)、65 μm PDMS/DVB固相萃取头(蓝头)、30 μm PDMS/DVB固相萃取头(黄头)，美国Supelco公司；22 mL顶空瓶，美国安捷伦(Agilent)科技有限公司；LIDA加热搅拌台，广东科力达仪器有限公司；LHS恒温恒湿箱，上海一恒科技有限公司；萘，99%，美国百灵威科技有限公司；乙醇，色谱纯，美国迪马公司。萘内标溶液：取0.100 g萘用乙醇自主配制成浓度为100 μg/mL的内标溶液。

1.3 GC-MS条件

1.3.1气相色谱条件。进样口温度280 ℃，载气为He，流速为1 mL/min；升温程序：初始温度50 ℃(保持2 min)，以5 ℃/min升温至140 ℃(保持1 min)，再以10 ℃/min升温至280 ℃(保持1 min)。

1.3.2质谱条件。离子源为EI源，电子能量为70 eV，质量扫描范围为35～350 amu。

1.4 数据检索采集的质谱数据经NIST标准谱库进行检索并鉴定，采取峰面积归一化法计算各物质的相对含量。

1.5 烟叶样品制备模拟烟叶自然霉变，将仓储烟叶放在恒温恒湿箱中，在适宜温湿度条件下(温度为28 ℃、相对湿度为60%)进行霉变试验，放置21 d后，得到霉变烟叶。将对应的正常烟叶与霉变烟叶分别置入旋风磨中，粉碎过40目筛，备用。

1.6 试验方法选取红花大金元同一份正常烟叶为对象；每次称取0.5 g烟叶粉末样品置于22 mL顶空瓶中，同时在顶空瓶中加入10 μL浓度为100 μg/mL的萘作为内标，及时封盖后将顶空瓶放置于加热搅拌台。将萃取头插入GC进样口于300 ℃老化1 h，直至无杂峰出现，并对条件进行优化：①对萃取头种类(黑头75 μm Carboxen-PDMS、黄头30 μm PDMS/DVB、白头85 μm PDMS/DVB、绿头7 μm PDMS)的优化；②对萃取温度(50、60、70、80、90 ℃)的优化；③对萃取时间(30、40、50、60 min)的优化；④对解吸附时间(1、2、3、4 min)的优化。将萃取的挥发性成分在GC进样口进行解吸附后，成分进入气相色谱-质谱联用仪，在“1.3”条件下分离与鉴定，以出峰数目和峰面积总量作为试验条件优化依据。采用NIST标准谱库进行检索，以萘内标作为参考，对挥发性化合物进行相对定量，正常烟叶与霉变烟叶总离子流图见图1所示。

根据优化条件，对不同品种(包括红大和K326)正常烟叶和霉变烟叶中挥发性成分种类进行测定，并采用Excel和SIMCA P+14.0软件对挥发性成分类型及标志性成分进行统计和筛选。

图1 正常烟叶(a)和霉变烟叶(b)总离子流图Fig.1 Total ion current diagram of normal tobacco(a)and mouldy tobacco(b)

2 结果与分析

2.1 萃取头的选取通过考察同一样品不同极性涂层的萃取头(黑头、白头、绿头和黄头)对烟叶挥发性成分的萃取效率的影响，结果显示，黑头(固定相为75 μm Carboxen-PDMS 涂层)萃取出的化合物最多，为58个，其他极性固定相涂层萃取头的化合物检出数分别为白头35个、绿头13个和黄头23个，因为黑色萃取头的出峰数目较多，最后选择黑头(固定相为75 μm Carboxen-PDMS 涂层)作为检测霉菌代谢挥发性物质的萃取头。

2.2 萃取温度对萃取效果的影响在萃取温度为50、60、70、80和90 ℃下进行测定，以“2.1”优化出的黑体为萃取头，挥发性成分的出峰数目分别为55、76、88、108和106个，各成分的峰面积归一化百分含量总量分别为70.55%、72.05%、73.33%、76.95%和77.05%，80 ℃条件下测得的化合物最多，总峰面积归一百分化含量与90 ℃检出的化合物相应的峰面积归一化百分含量相差不大，最终选择检出峰最多的80 ℃作为萃取温度条件。

2.3 萃取时间对萃取效果的影响根据“2.1”和“2.2”优化的条件，进一步考察不同萃取时间(30、40、50和60 min)对萃取效果的影响。结果表明，不同萃取时间下，出峰化合物数目分别为108、120、122和118个，峰面积归一化百分含量分别为83.18%、80.33%、82.67%和80.59%，50 min时出峰数目最多，总峰面积归一化百分含量比30 min的略低，综合考虑后选择50 min作为萃取时间。

2.4 解吸附时间对解析效果的影响根据“2.1”“2.2”和“2.3”优化条件，分别在解吸附时间为1、2、3和4 min的条件下进行测定。结果表明，不同解吸附时间下，挥发性成分的出峰数目分别为95、98、96和92个，说明解吸附时间对测定影响不大，综合考虑后选择2 min作为解吸附时间。

2.5 方法重现性在22 mL顶空瓶中加入相同量的萘内标溶液，采用HS-SPME-GC-MS平行测定6次，6次测定的相对标准偏差(RSD)小于20%，说明所建立的测定方法的精密度满足霉变烟叶中挥发性成分的测定。

2.6 正常烟叶与霉变烟叶样品检测根据“2.1～2.5”优化结果，通过对不同品种正常和霉变烟叶中挥发性成分进行测定，对挥发性成分种类进行综合统计，结果见图2；并对正常和霉变烟叶中差异标志物进行对应分析，筛选出霉变烟叶的标志成分，结果如表1所示。

由图2可知，正常烟叶和霉变烟叶所检测出的挥发性成分中检测出的种类均超过95种，其中酮类和醛类均较多，分别为22、18种和20、16种。

由表1可知，对正常烟叶和霉变烟叶挥发性成分的含量进行对比分析，筛选出8种挥发性成分，分别为5-甲基-2-呋喃甲醇、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、1，2-二甲氧基-苯、2，4-二氯-1-甲氧基-苯、5-甲氧基-6，7-二甲基-苯并呋喃、十六酸甲酯和十六酸，这些挥发性成分在正常烟叶和霉变烟叶中差异较大。

图2 正常烟叶与霉变烟叶挥发性成分种类占比统计Fig.2 Statistics of the percentage of the types of volatile components in normal and mouldy tobacco leaves

表1 相对定量检测结果对比Table 1 Comparison of relative quantitative test results 单位：μg/g

图3 正常烟叶和霉变烟叶8种挥发性成分主成分得分Fig.3 Main component scores of 8 volatile components in normal and mouldy tobacco leaves

进一步将所筛选的挥发性成分进行主成分和聚类分析，对8种标志物筛选的合理性进行分析，结果如图3～4所示。由图3可知，8种挥发性成分可将正常烟叶和霉变烟叶有效识别，前2个主成分累计贡献率为89.1%。

图4 正常烟叶和霉变烟叶8种挥发性成分的聚类图Fig.4 Cluster diagram of 8 volatile components in normal and mouldy tobacco leaves

在阈值为10时，所筛选的8种挥发性成分可将不同品种(包括红大和K326)的正常烟叶和霉变烟叶进行有效聚类。结果表明所筛选的8种挥发性成分可作为霉变烟叶和正常烟叶的识别依据，为后续早期霉变烟叶的数据化识别提供基础依据。

3 结论

该研究建立基于SPME结合GC-MS法测定霉变烟叶中挥发性成分的方法，对影响SPME萃取效率的因素(萃取头种类、萃取温度、萃取时间和解吸附时间)进行了优化，得到了较优的萃取条件：采用固定相为75 μm Carboxen-PDMS 涂层的黑头萃取头，在80 ℃下萃取样品50 min，萃取头在气相色谱进样口解吸附2 min的条件下进行测定。对方法的重现性进行考察，6次测定结果的RSD值小于20%，说明所建立方法具有较好的重现性。

基于以上方法步骤，对正常烟叶和霉变烟叶的挥发性化合物进行测定，发现有8个化合物存在明显的特征，分别为5-甲基-2-呋喃甲醇、1-辛烯-3-醇、苯甲醇、1，2-二甲氧基-苯、2，4-二氯-1-甲氧基-苯、5-甲氧基-6，7-二甲基-苯并呋喃、十六酸甲酯和十六酸。通过监测这些化合物含量的变化可以用于识别烟叶霉变程度，该研究为判定烟叶霉变程度及烟叶霉变预防提供了技术支撑，可降低烟叶霉变带来的经济损失，同时为霉变烟叶的快速识别提供基础依据。