高义霞，呼丽萍

(1.天水师范学院生物工程与技术学院，甘肃天水 741001；2.甘肃省大樱桃工程技术研究中心，甘肃天水 741001)

我国是世界苹果产业规模最大的国家之一，2014年苹果栽培面积和产量分别达到226万hm2和3 800万t，幼果达285万t[1]。其中，甘肃省苹果栽培面积和年产量分别达到32万hm2和320万t，幼果约24万t[2]。而幼果中的多酚提取率为成熟果实的10倍，是苹果多酚丰富的来源，开发价值很高[3]。研究表明，苹果多酚的许多生理功能(如抗龋齿[4-5]、抗氧化等)比茶多酚高100倍以上，因此开发苹果多酚制品具有广阔的销售市场。目前绝大多数苹果幼果被废弃，极少量以沼气或者饲喂家禽等方式消化，既污染了自然环境，又造成极大的资源浪费[6]。苹果多酚提取工艺主要有溶剂萃取法、高压萃取技术及二氧化碳超临界萃取技术等，这些方法在提取效率、节能及自动化等方面尚有不足[7]。而超声辅助提取法具有效率高、能量低以及节省溶剂等特点，正逐渐成为有效提取多酚等活性物质的新兴技术[8]。王贤萍等[9]利用超声波辅助法提取山西嘎啦苹果多酚，确定最佳工艺为乙醇体积分数50%，提取时间60 min，pH 3，料液比1∶6，超声功率80 W，在该条件下含量可达到1 692.72 mg/kg。李珍等[10]利用超声波辅助法提取苹果皮渣多酚，确定最佳提取工艺为提取时间10 min，超声功率500 W，提取温度65 ℃，料液比1∶30，在该条件下实际测定的总酚含量可达到4.53 mg/g。为了充分利用当地特色果品“花牛”苹果幼果，笔者采取超声辅助果胶酶法提取苹果多酚，在单因素试验的基础上，通过响应面法优化提取参数，确定苹果多酚最佳工艺条件，以期为花牛苹果幼果的资源利用及其多酚开发提供理论依据，也为苹果多酚在食品及医药行业的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器花牛苹果幼果，采自甘肃省天水市麦积区中滩镇九龙山苹果基地，时间2016年6月5日，处理前保存于0 ℃冷库中。福林酚试剂(Folin-Ciocalteu)，上海润顺化工有限公司；没食子酸标准品(≥99%)、阿拉丁试剂、果胶酶，sigma公司；异抗坏血酸，湖南世纪华星生物工程有限公司；无水乙醇，国产分析纯。

KQ-500型超声波清洗器，昆山市超声仪器；紫外-可见分光光度计(UV-2450)，日本岛津；料理机(JYL-C022)，九阳集团。

1.2 苹果多酚提取取花牛苹果幼果，去核除蒂，按10∶1的比例(M/V，g/mL)加入10%异抗坏血酸作为护色剂，破碎后准确称取样品10.000 g，加入果胶酶酶解[11]，乙醇超声波提取，提取液抽滤后收集滤液，定容备用。

1.3 标准曲线制作和多酚提取率测定多酚提取率测定采用Folin-Ciocalteu法[12-13]。吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL没食子酸标准使用液(50 μg/mL)于25 mL容量瓶中，分别添加3.0 mL Folin-Ciocalteu试剂，反应5 min后分别加入2.0 mL 10% Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至刻度，30 ℃避光水浴30 min，测定OD690。

标准曲线方程Y=0.179 3X+0.000 3

式中，Y为OD，X为多酚提取率，μg/mL。取1.0 mL同标准曲线操作，计算多酚提取率。

多酚提取率公式为

C=X×V×N/M

式中，C为多酚提取率，μg/g；V为体积，mL；N为稀释倍数；M为样品质量，g。

1.4 单因素试验

1.4.1提取时间对多酚提取率的影响。称取样品10.0 g 6份，在料液比1∶6、乙醇体积60%、超声波功率60 W、温度50 ℃，时间分别为10、20、30、40、50、60 min的条件下提取，计算多酚提取率，平行3次。

1.4.2料液比对多酚提取率的影响。称取样品10.0 g 6份，设定超声波功率60 W、温度50 ℃、提取时间50 min、乙醇体积60%，在料液比分别为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的条件下提取，计算多酚提取率，平行3次。

1.4.3乙醇体积分数对多酚提取率的影响。称取样品10.0 g 6份，设定超声波功率60 W、温度50 ℃、提取时间50 min、料液比1∶6，分别加入体积分数40%、50%、60%、70%、80%的乙醇提取，计算多酚提取率，平行3次。

1.4.4超声波功率对多酚提取率的影响。称取样品10.0 g 6份，在料液比1∶6、乙醇体积分数70%、提取温度50 ℃、提取时间50 min，超声波功率分别20、40、60、80、100 W的条件下提取，计算多酚提取率，平行3次。

1.4.5提取温度对多酚提取率的影响。称取打浆后的样品10.0 g 6份，在料液比1∶6、乙醇体积分数70%、设定超声波功率100 W、提取时间50 min，在20、30、40、50、60、70、80 ℃的条件下提取，计算多酚提取率，平行3次。

1.5 响应面优化苹果幼果多酚提取工艺根据单因素试验结果进行4因素3水平的响应面优化试验，条件设计见表1。

表1 响应面因素水平试验设计Table 1 Response surface factor level experiment design

在优化试验中以提取时间(A)、料液比(B)、乙醇体积分数(C)、提取温度(D)为自变量，以花牛苹果幼果多酚提取率为考察指标，共设计29个试验点，其中24个分析点，中心试验重复5次，用来估计试验误差。

1.6 数据处理采用SPSS 16.0分析数据。

2 结果与分析

2.1 提取时间对苹果多酚提取率的影响由图1可知，随着提取时间的延长，苹果多酚提取率呈先上升后下降趋势，70 min时提取率最大。原因可能是提取时间过短，多酚未被完全提取，提取时间过长，则导致其他可溶性物质被溶出，且多酚易发生不同程度的分解。

图1 提取时间对苹果多酚提取率的影响Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of apple polyphenols

2.2 料液比对苹果多酚提取率的影响由图2可知，苹果多酚提取率随料液比的增加先升高后下降，当料液比为1∶6时提取率达到最大值，为9.206 mg/g。原因可能是超声波振动提取时，苹果超微结构遭到破坏，提取效率升高[14]。而当料液比达到一定程度后，继续提高料液比会使多酚提取率下降，可能原因是料液比较小时，幼果细胞吸收的超声波能量较多，细胞破碎程度较好，多酚更容易被释放到溶剂中；料液比过大时，超声波能量的吸收程度较小，细胞破碎程度减小，多酚物质不易被释放；但是如果料液比过小，溶解多酚的溶剂就会过少，效果亦不佳。

图2 料液比对苹果多酚提取率的影响Fig.2 Effect of material liquid ratio on extraction rate of apple polyphenols

2.3 乙醇体积分数对苹果多酚提取率的影响由图3可知，随着乙醇体积分数的增大，苹果多酚提取率呈先上升后下降的趋势，当乙醇体积分数为70%时，多酚提取率达最大值，为9.095 mg/g。原因可能是幼果多酚一部分为醇溶性，另一部分为水溶性，且两者比例相当[15]。当提取液浓度过低时，醇溶性多酚未充分释放，反之，水溶性未充分溶解，只有在醇水比例相当时效果最佳。

图3 乙醇体积分数对苹果多酚提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of apple polyphenol

2.4 超声波功率对苹果多酚提取率的影响由图4可知，苹果多酚提取率随着超声波功率的增加而逐渐增大，当超声波功率为100 W时，提取率达到最大值，为10.625 mg/g。原因可能是功率过小，振动能低，不能充分提取。

图4 超声波功率对苹果多酚提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of apple polyphenols

2.5 提取温度对苹果多酚提取率的影响由图5可知，苹果多酚提取率随提取温度的升高呈先上升后下降趋势，当提取温度为70 ℃时提取率最大为11.035 mg/g。原因可能是温度升高，会使物质内的分子运动加快，多酚类物质的扩散与渗透的速度加快，使多酚更易溶出。但是温度过高时，会破坏多酚的结构，提取率下降，这与文献报道结论一致[14，16]。

图5 提取温度对苹果多酚提取率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of apple polyphenols

2.6 响应面优化苹果多酚的提取工艺

2.6.1回归模型的建立及统计检验。响应面分析方案及试验结果见表2。利用Design-Expert 8.0.6软件对表2中数据进行多项式回归分析[17]，建立花牛苹果幼果多酚提取率的模型，得到拟合多元二次响应面回归方程为

Y=11.52+0.14A-0.23B+0.22C+0.44D-0.79AB+0.47AC+0.62AD-0.12BC-0.71BD+0.023CD-2.07A2-0.96B2-2.38C2-1.48D2

对该模型进行方差分析可知，回归模型P<0.01，结果有显著差异，说明模型有意义。失拟项P=0.116 6>0.05，表示无显著性差异，说明模型拟合情况良好。回归方程的二次项A2、B2、C2、D2的系数为负值，则该方程的抛物面开口朝下，具有极大值点，可以进行最优分析。由表3可知，一次项对苹果多酚提取率的影响从大到小依次为提取温度(D)、料液比(B)、乙醇体积分数(C)、提取时间(A)，一次项超声波提取温度(D)对多酚提取率的影响达显著水平，交互项提取时间和提取温度(AD)、料液比和提取温度(BD)达极显著，提取时间和料液比(AB)、提取时间和乙醇体积分数(AC)为显著水平，二次项影响均为极显著，其他无显著。

表2 响应面分析方案及试验结果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

2.6.2超声波辅助提取苹果多酚各因素间的交互作用。响应面图是反映响应面在整个试验交互作用下得到的结果，构成三维空间曲面，可以预测和确定变量的交互作用。分析当2个因素不变时，另外2个因素及其交互作用对多酚提取率的影响，各因素交互情况见图6。

表3 方差分析结果Table 3 Results of ANOVA

图6 两因素交互作用对苹果多酚提取率的响应面图Fig.6 Response surface diagram of the influence of the interaction of two factors on the extraction rate of apple polyphenols

由图6a可知，固定料液比为1∶6，提取温度为60 ℃，随着提取时间的延长和乙醇体积分数的增加，苹果多酚提取率先增大后减少，且乙醇体积分数对苹果多酚提取率的影响大于提取时间。由图6b可知，固定乙醇体积分数70%，提取温度为60 ℃，随着提取时间的延长和料液比的增加，苹果多酚提取率先增加后减少，料液比对苹果多酚提取率的影响大于提取时间。由图6c可知，固定料液比为1∶6，乙醇体积分数为70%，随着提取时间的延长和提取温度的升高，苹果多酚提取率先增加后减少，提取温度对苹果多酚提取率的影响大于提取时间。由图6d可知，固定提取时间为50 min，提取温度为60 ℃，随着乙醇体积分数和料液比的增大，苹果多酚提取率先增加后减少，且乙醇体积分数对苹果多酚提取率的影响大于料液比。由图6e可以看出，固定提取时间为50 min，乙醇体积分数为70%，随着提取温度的升高和料液比的增大，苹果多酚提取率先增加后减少，且提取温度对苹果多酚提取率的影响大于料液比。由图6f可知，固定提取时间为50 min，料液比为1∶6，随着提取温度的升高和乙醇体积分数的增大，苹果多酚提取率先增加后减少，提取温度对苹果多酚提取率的影响大于乙醇体积分数。

该试验通过研究超声波功率、提取时间、提取温度、乙醇体积分数、料液比对苹果多酚提取率的影响，使用Design-Expert 8.0.6软件设计，优化得出超声波辅助提取花牛苹果幼果中多酚的最佳工艺为：超声波功率100 W，提取时间50.65 min，乙醇体积分数70.67%，料液比1∶5.73，提取温度62.39 ℃，苹果多酚提取率为11.620 mg/g。但在实际工艺中为了操作方便，将工艺条件设置为超声波功率100 W，提取时间51 min，乙醇体积分数71%，料液比1∶6，提取温度62 ℃，该条件下重复5次试验验证工艺的稳定性，幼果多酚平均提取率为11.586 mg/g，这与理论预测值(11.620 mg/g)接近。可见，试验设计优化得到的花牛苹果幼果多酚提取工艺条件准确、稳定、可行。

3 结论

该研究在单因素试验的基础上，结合响应面法优化微波辅助法提取苹果多酚的工艺，建立苹果多酚得率的二次多项数学模型。该模型极显著，拟合情况良好。最佳工艺参数：超声波功率100 W，提取时间51 min，提取温度为62 ℃，料液比1∶6，乙醇体积分数71%，苹果多酚的提取率为11.586 mg/g。